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panda73金蟲 (小有名氣)
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影響酶切的幾個(gè)主要因素 已有7人參與
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影響酶切的幾個(gè)主要因素： 1. 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量 1）質(zhì)粒DNA的質(zhì)量是決定酶切效率的最最要的因素。通常在克隆時(shí)，如果反復(fù)優(yōu)化酶切條件后，都不能實(shí)現(xiàn)完全酶切，最可能的原因就是質(zhì)粒DNA的質(zhì)量有問(wèn)題。 2）DNA的質(zhì)量監(jiān)測(cè)通常有兩個(gè)方法：首先OD260/OD280比值應(yīng)該在1.8左右（1.7-1.9），否則意味著DNA樣品中存在大量的蛋白質(zhì)或RNA污染。其次，瓊脂糖電泳分析時(shí)應(yīng)主要以超螺旋條帶為主。最多不超過(guò)三條帶（分別為超螺旋DNA，線性化DNA和環(huán)狀DNA）。否則意味質(zhì)粒DNA的質(zhì)量不高，應(yīng)該重新制備。 2.限制性內(nèi)切酶的活性 1）限制性內(nèi)切酶一般需要低溫保存，而且反復(fù)的升降溫過(guò)程對(duì)酶活性的損害很明顯。因而為了確保在有效期內(nèi)的限制性內(nèi)切酶不會(huì)失活，限制性內(nèi)切酶的日常保存和使用應(yīng)當(dāng)很小心。 2）建議購(gòu)買具有保溫功能的凍存盒保存限制性內(nèi)切酶（-20度），而且取用限制性內(nèi)切酶時(shí)，也應(yīng)該使用具有保溫功能的凍存盒，盡量防止酶的溫度反復(fù)出現(xiàn)大的波動(dòng)。 3.限制性內(nèi)切酶的用量 1）限制性內(nèi)切酶的單位定義通常為：在合適的溫度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定義為一個(gè)單位。 2）在這個(gè)單位定義中，有幾個(gè)不確定因素：首先是底物，不同的酶單位定義是選擇的底物可能不同（常用的幾個(gè)底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些質(zhì)粒DNA）；第二個(gè)不確定因素是限制性內(nèi)切酶在底物DNA上的酶切位點(diǎn)的個(gè)數(shù)。由于單位定義中要求完全消化，因而底物上某個(gè)酶的酶切位點(diǎn)的個(gè)數(shù)的多少，就直接影響了該酶的單位定義。 3）因而，在進(jìn)行酶切時(shí)，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科學(xué)的，這也導(dǎo)致在實(shí)際工作中，大家要進(jìn)行多次預(yù)實(shí)驗(yàn)才能確定最合適酶切條件。 4）以前，我推薦了一個(gè)在線的雙酶切設(shè)計(jì)軟件，double digestion designer, 可以精確地計(jì)算酶切時(shí)的限制性內(nèi)切酶的用量。使用中，能夠注意到，用來(lái)進(jìn)行雙酶切的兩個(gè)酶的用量有時(shí)竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且發(fā)現(xiàn)，小片段PCR產(chǎn)物（100-500bp）進(jìn)行酶切時(shí)，需要的酶量比質(zhì)粒DNA酶切時(shí)用量多10倍以上。 5）該軟件目前可以免費(fèi)使用，用戶名和密碼都是test。http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php [ Last edited by panda73 on 2012-2-27 at 16:42 ] |
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西瓜(金幣+2): 鼓勵(lì)交流！ 2012-02-29 18:21:02
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| 如果是你自己總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)，可以交流下。如果你用TAKARA酶以及建庫(kù)就要另當(dāng)別論了，我之前建庫(kù)，挑了幾百個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序和酶切驗(yàn)證，都連進(jìn)去了，認(rèn)為是百分之百。后來(lái)幾次擴(kuò)庫(kù)后，便出現(xiàn)空載體。說(shuō)明還是沒(méi)切干凈，只不過(guò)幾率比較低，大概再萬(wàn)分之一，你挑幾十個(gè)克隆驗(yàn)證根本看出來(lái)。不過(guò)不影響庫(kù)質(zhì)量。用得水也挺有關(guān)系，當(dāng)時(shí)我試了很多水，發(fā)現(xiàn)用我們自己蒸餾出的三蒸水似乎要好于Miniipore18兆歐的水。 |
5樓2012-02-29 11:03:03
十口心思
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小丹木木(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2012-02-29 08:18:11
| 得看用什么牌子酶了，現(xiàn)在的酶如NEB的HF酶，MBI的FAST酶都很好，無(wú)論切質(zhì)粒還是PCR產(chǎn)物效率都很好。不用考慮那么多，也用不了那么多倍。質(zhì)粒別降解了就行，至于兩條帶還是三條帶，做個(gè)克隆無(wú)所謂�，F(xiàn)在用盒子提的質(zhì)粒，純度都還不錯(cuò)。還有是任何生物反應(yīng)不可能達(dá)到完全，酶切反應(yīng)不能實(shí)現(xiàn)完全酶切的，無(wú)論你怎么優(yōu)化。金無(wú)足赤。 |
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10樓2012-03-05 21:56:30
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