 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 6007 | 回復(fù): 13 | |||||||||
panda73金蟲(chóng) (小有名氣)
|
[交流]
影響酶切的幾個(gè)主要因素 已有7人參與
|
||||||||
|
影響酶切的幾個(gè)主要因素： 1. 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量 1）質(zhì)粒DNA的質(zhì)量是決定酶切效率的最最要的因素。通常在克隆時(shí)，如果反復(fù)優(yōu)化酶切條件后，都不能實(shí)現(xiàn)完全酶切，最可能的原因就是質(zhì)粒DNA的質(zhì)量有問(wèn)題。 2）DNA的質(zhì)量監(jiān)測(cè)通常有兩個(gè)方法：首先OD260/OD280比值應(yīng)該在1.8左右（1.7-1.9），否則意味著DNA樣品中存在大量的蛋白質(zhì)或RNA污染。其次，瓊脂糖電泳分析時(shí)應(yīng)主要以超螺旋條帶為主。最多不超過(guò)三條帶（分別為超螺旋DNA，線性化DNA和環(huán)狀DNA）。否則意味質(zhì)粒DNA的質(zhì)量不高，應(yīng)該重新制備。 2.限制性內(nèi)切酶的活性 1）限制性內(nèi)切酶一般需要低溫保存，而且反復(fù)的升降溫過(guò)程對(duì)酶活性的損害很明顯。因而為了確保在有效期內(nèi)的限制性內(nèi)切酶不會(huì)失活，限制性內(nèi)切酶的日常保存和使用應(yīng)當(dāng)很小心。 2）建議購(gòu)買(mǎi)具有保溫功能的凍存盒保存限制性內(nèi)切酶（-20度），而且取用限制性內(nèi)切酶時(shí)，也應(yīng)該使用具有保溫功能的凍存盒，盡量防止酶的溫度反復(fù)出現(xiàn)大的波動(dòng)。 3.限制性內(nèi)切酶的用量 1）限制性內(nèi)切酶的單位定義通常為：在合適的溫度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定義為一個(gè)單位。 2）在這個(gè)單位定義中，有幾個(gè)不確定因素：首先是底物，不同的酶單位定義是選擇的底物可能不同（常用的幾個(gè)底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些質(zhì)粒DNA）；第二個(gè)不確定因素是限制性內(nèi)切酶在底物DNA上的酶切位點(diǎn)的個(gè)數(shù)。由于單位定義中要求完全消化，因而底物上某個(gè)酶的酶切位點(diǎn)的個(gè)數(shù)的多少，就直接影響了該酶的單位定義。 3）因而，在進(jìn)行酶切時(shí)，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科學(xué)的，這也導(dǎo)致在實(shí)際工作中，大家要進(jìn)行多次預(yù)實(shí)驗(yàn)才能確定最合適酶切條件。 4）以前，我推薦了一個(gè)在線的雙酶切設(shè)計(jì)軟件，double digestion designer, 可以精確地計(jì)算酶切時(shí)的限制性內(nèi)切酶的用量。使用中，能夠注意到，用來(lái)進(jìn)行雙酶切的兩個(gè)酶的用量有時(shí)竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且發(fā)現(xiàn)，小片段PCR產(chǎn)物（100-500bp）進(jìn)行酶切時(shí)，需要的酶量比質(zhì)粒DNA酶切時(shí)用量多10倍以上。 5）該軟件目前可以免費(fèi)使用，用戶名和密碼都是test。http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php [ Last edited by panda73 on 2012-2-27 at 16:42 ] |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專(zhuān)輯推薦
 留學(xué)海外 | 分子生物學(xué)資料 | 分子生物實(shí)驗(yàn)相關(guān) | 分子實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題 |
| 測(cè)序 | 生物技術(shù)/方法講解 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
酶切專(zhuān)家» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有157人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專(zhuān)業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 雙酶切后，質(zhì)粒條帶彌散
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 三螺旋DNA的設(shè)計(jì)應(yīng)該注意什么
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 建庫(kù)酶切問(wèn)題求助��！
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 幾個(gè)關(guān)鍵的時(shí)間點(diǎn)如何確定
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 糾結(jié)的分子實(shí)驗(yàn)，雙酶切連不上，求助
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 在做酶切時(shí)不小心用質(zhì)粒污染了酶,那酶還能用嗎
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 怎樣確定完全抑制酶活
已經(jīng)有1人回復(fù)
- （侯氏出品）雙酶切連接反應(yīng)之全攻略
已經(jīng)有89人回復(fù)
- 影響Si nanoparticle的initial coulombic efficiency的因素都有哪些啊
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 酶與果蔬加工Enzymes in Fruit and Vegetable Processing(2010)
已經(jīng)有178人回復(fù)
- EcoRI 酶切細(xì)菌基因組切不開(kāi)
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 關(guān)于酶解單因素的實(shí)驗(yàn)
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 分子標(biāo)記，有沒(méi)有抗感親本沒(méi)有差異，F(xiàn)2群體卻發(fā)生分離的情況
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 16rRNA序列酶切后，帶型相同的菌株被確認(rèn)在哪個(gè)分類(lèi)水平了？
已經(jīng)有9人回復(fù)
- DFT計(jì)算和X射線發(fā)射光譜研究金屬表面小分子吸附電子結(jié)構(gòu)
已經(jīng)有26人回復(fù)
- XcmI酶切不開(kāi)的可能原因
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 酶切的影響因素
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 求教關(guān)于用QIAquick PCR Purification Kit 是否能用來(lái)回收雙酶切過(guò)的pcr產(chǎn)物
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 新手想知道如何用Amber做蛋白質(zhì)分子固定某兩個(gè)或多個(gè)氨基酸距離的MD計(jì)算
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】不完全酶切
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 【分享】使用cubegen程序做分子的total electronic densities
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 【求助/交流】影響酶切的因素？
已經(jīng)有25人回復(fù)
酶切專(zhuān)家
金蟲(chóng) (小有名氣)
- MolEPI: 2
- 應(yīng)助: 96 (初中生)
- 金幣: 1610.8
- 紅花: 4
- 帖子: 149
- 在線: 41.3小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1648414
- 注冊(cè): 2012-02-27
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
2樓2012-02-28 10:57:03
十口心思
木蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 16 (小學(xué)生)
- 金幣: 2417.9
- 散金: 64
- 帖子: 261
- 在線: 152.7小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 347022
- 注冊(cè): 2007-04-15
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 抗體工程學(xué)
★
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
西瓜(金幣+2): 鼓勵(lì)交流！ 2012-02-29 18:21:02
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
西瓜(金幣+2): 鼓勵(lì)交流！ 2012-02-29 18:21:02
| 如果是你自己總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)，可以交流下。如果你用TAKARA酶以及建庫(kù)就要另當(dāng)別論了，我之前建庫(kù)，挑了幾百個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序和酶切驗(yàn)證，都連進(jìn)去了，認(rèn)為是百分之百。后來(lái)幾次擴(kuò)庫(kù)后，便出現(xiàn)空載體。說(shuō)明還是沒(méi)切干凈，只不過(guò)幾率比較低，大概再萬(wàn)分之一，你挑幾十個(gè)克隆驗(yàn)證根本看出來(lái)。不過(guò)不影響庫(kù)質(zhì)量。用得水也挺有關(guān)系，當(dāng)時(shí)我試了很多水，發(fā)現(xiàn)用我們自己蒸餾出的三蒸水似乎要好于Miniipore18兆歐的水。 |
5樓2012-02-29 11:03:03
十口心思
木蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 16 (小學(xué)生)
- 金幣: 2417.9
- 散金: 64
- 帖子: 261
- 在線: 152.7小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 347022
- 注冊(cè): 2007-04-15
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 抗體工程學(xué)
★
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
小丹木木(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2012-02-29 08:18:11
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
小丹木木(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2012-02-29 08:18:11
| 得看用什么牌子酶了，現(xiàn)在的酶如NEB的HF酶，MBI的FAST酶都很好，無(wú)論切質(zhì)粒還是PCR產(chǎn)物效率都很好。不用考慮那么多，也用不了那么多倍。質(zhì)粒別降解了就行，至于兩條帶還是三條帶，做個(gè)克隆無(wú)所謂�，F(xiàn)在用盒子提的質(zhì)粒，純度都還不錯(cuò)。還有是任何生物反應(yīng)不可能達(dá)到完全，酶切反應(yīng)不能實(shí)現(xiàn)完全酶切的，無(wú)論你怎么優(yōu)化。金無(wú)足赤。 |
3樓2012-02-29 01:11:50
panda73
金蟲(chóng) (小有名氣)
- MolEPI: 3
- 應(yīng)助: 80 (初中生)
- 金幣: 1201.3
- 散金: 44
- 紅花: 2
- 帖子: 191
- 在線: 42.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 985964
- 注冊(cè): 2010-03-30
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
4樓2012-02-29 09:53:34
6樓2012-02-29 17:34:53
7樓2012-03-05 13:52:43
amilie030312
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- MolEPI: 2
- 應(yīng)助: 7 (幼兒園)
- 金幣: 644.8
- 帖子: 407
- 在線: 47.3小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 296900
- 注冊(cè): 2006-11-18
- 專(zhuān)業(yè): 動(dòng)物遺傳學(xué)
8樓2012-03-05 16:02:50
xlchangbin
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 164
- 帖子: 36
- 在線: 6.3小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1322632
- 注冊(cè): 2011-06-14
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 畜牧學(xué)
9樓2012-03-05 16:35:01
panda73
金蟲(chóng) (小有名氣)
- MolEPI: 3
- 應(yīng)助: 80 (初中生)
- 金幣: 1201.3
- 散金: 44
- 紅花: 2
- 帖子: 191
- 在線: 42.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 985964
- 注冊(cè): 2010-03-30
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
10樓2012-03-05 21:56:30
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 panda73 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿北京化工大學(xué) 070300 學(xué)碩 336分 求調(diào)劑 +4 | vv迷 2026-03-22 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 352求調(diào)劑 +3 | 大米飯！ 2026-03-22 | 3/150 |
|
|
[考研] 一志愿 西北大學(xué) ，070300化學(xué)學(xué)碩，總分287，雙非一本，求調(diào)劑。 +3 | 晨昏線與星海 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +3 | 26研0 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考博] 招收博士1-2人 +3 | QGZDSYS 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿華中科技大學(xué)071000，求調(diào)劑 +4 | 沿岸有貝殼6 2026-03-21 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | 13341 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 266求調(diào)劑 +3 | 哇呼哼呼哼 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 332求調(diào)劑 +3 | 鳳凰院丁真 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 296求調(diào)劑 +6 | www_q 2026-03-18 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 材料學(xué)求調(diào)劑 +4 | Stella_Yao 2026-03-20 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | @taotao 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[論文投稿]
申請(qǐng)回稿延期一個(gè)月，編輯同意了。但系統(tǒng)上的時(shí)間沒(méi)變，給編輯又寫(xiě)郵件了，沒(méi)回復(fù)
 10+3
|
wangf9518 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考博] 申博26年 +3 | 八6八68 2026-03-19 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 288求調(diào)劑，一志愿華南理工大學(xué)071005 +5 | ioodiiij 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料工程專(zhuān)碩調(diào)劑 +5 | 204818@lcx 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 【同濟(jì)軟件】軟件（085405）考研求調(diào)劑 +3 | 2026eternal 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 收復(fù)試調(diào)劑生 +4 | 雨后秋荷 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +3 | 妮妮ninicgb 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[論文投稿] 有沒(méi)有大佬發(fā)小論文能帶我個(gè)二作 +3 | 增銳漏人 2026-03-17 | 4/200 |
|