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jyongchao木蟲 (正式寫手)
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[求助]
DNA雙酶切后在兩端加adapter的連接問題
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各位高手，最近在做MSAP，要求先將總DNA經(jīng)EcoR I 和Msp I（或Hpa II）酶切，然后在所有DNA片段兩端要加上接頭，PCR后跑膠看條帶，對其中的連接一步不太懂，想請教幾個問題： 1、我的adapters有四個：EcoRI-adapterI、EcoRI-adapter II、H/M-adapterI、H/M-adapter II 都是合成的單鏈，如果進行連接是不是先要分別將EcoRI-adapterI和EcoRI-adapter II、H/M-adapterI和H/M-adapter II 配對后才能連？怎么配對呢？ 直接56℃退火？ 2、我的T4連接酶是TaKaRa的，說明書上的例子是載體連接，這個連接體系能不能用到我這個上呢？因為包裝是350U/ul ，說明書上是加了1ul 過夜16℃反應(yīng)，感覺酶有點多呀 3、EcoRI-adapter和H/M-adapter的比例、adapter與總DNA量的比例調(diào)成多少才能有比較好的連接效率？ 4、連接完成后直接PCR對最后的PCR效果有沒有影響？ [ Last edited by jyongchao on 2011-10-16 at 20:57 ] |
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