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lxy19870124鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
wb，條帶異常，拖尾，彌散。 已有2人參與
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我崩潰了，做了很多次都是這樣子的，不知道什么原因，上圖�。�！ [img]就這熊樣 條帶中空 背景很深，我是挑不深的上的 無語 |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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lxy19870124
鐵蟲 (初入文壇)
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2樓2011-11-17 15:26:53
lxy19870124
鐵蟲 (初入文壇)
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3樓2011-11-17 15:30:08
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
wanhscn(金幣+3): 鼓勵應(yīng)助！ 2011-11-18 19:31:00
wanhscn(金幣+3): 鼓勵應(yīng)助！ 2011-11-18 19:31:00
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條帶中空，很大可能是在壓片前，蓋保鮮薄膜時有氣泡引起的。注意把保鮮膜捋平。 條帶拖尾確實(shí)很嚴(yán)重，是不是濃縮膠的長度不夠，下回可試一試將濃縮膠的長度制得長一些，將蛋白更好地濃縮；或者根據(jù)你的蛋白分子量，看看選擇的分離膠比例是否合適了，太稀時對蛋白可能有點(diǎn)彌散，所以選擇分離膠的比例也很重要。背景較高，可以再適當(dāng)調(diào)整一下一抗二抗的稀釋度或者延長封閉時間、洗膜時間或增加洗膜次數(shù)，另外，曝光的時間可再縮短一些。祝你下回實(shí)驗(yàn)成功。 |
4樓2011-11-17 19:18:55
zengmud2
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5樓2011-11-17 21:11:24
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【答案】應(yīng)助回帖
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可能在電泳和免疫印跡兩方面都有問題。 一、SDS PAGE電泳帶彌散和拖尾的原因和改進(jìn)措施(2013-10-7) 1.原因一：上樣量過多，應(yīng)該減少上樣量。對策：加樣體積根據(jù)樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15μL（即2-10μg蛋白質(zhì)）。如果樣品很稀上樣量可以達(dá)到100μL。 2.原因二：樣品溶解不完全。 對策： （1）樣品應(yīng)該充分溶解：保持各種蛋白質(zhì)樣品和Marker在上樣前能夠充分溶解，上樣前最好離心一下，實(shí)在溶解不掉的顆粒就去掉。 (2)可以根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)試劑盒的要求加入樣品溶解液；如果是自行配置標(biāo)準(zhǔn)和未知樣品，按照0.5-1.0mg/L樣品溶解液。溶解后，將其轉(zhuǎn)移至Eppendorf管，蓋上蓋子（可以在蓋子處加上卡子）后在110度沸水中水浴加熱3分鐘（可以在薄泡沫塑料板上鉆出幾個與Eppendorf管直徑形同的圓洞，Eppendorf管放下去直到蓋子邊緣約束不能再往下為止，把薄泡沫塑料板的暴露出Eppendorf管的管體大部分的那一面放入沸水浴鍋中，薄泡沫塑料板自然飄在沸水表面，便于取用和加熱，也可避免沸水濺起。可以一批對于多個Eppendorf管進(jìn)行不同時間的沸水浴。不要把Eppendorf管扔進(jìn)沸水浴鍋中，蓋子可能會被沖開），而后在室溫下冷卻待用。如果較長時間不用，則將樣品放入零下20度冰箱中儲存，需用時在取出后使用前在110度沸水中加熱3分鐘室溫冷卻后再上樣，以去掉樣品蛋白質(zhì)中的亞穩(wěn)態(tài)聚合體。 （3）改變樣品緩沖溶液使得樣品能夠充分溶解，SDS 用量要充分。 “一”的問題應(yīng)該是說主要的�？赡苡蠾B背景高的問題，但是不明顯。 二、WB背景高的可能原因與解決方法（可能不是原因或者主要原因） 1.洗膜不充分，增加洗滌液的體積和洗滌次數(shù)；在洗滌液中加入Tween=20。 2.二抗?jié)舛冗^高，引起了一些非專一性的抗原-抗體相互作用，適當(dāng)降低二抗?jié)舛�，可以分梯度進(jìn)行。 3.二抗的識別抗原免疫簇不唯一，這是因?yàn)槎故嵌嗫寺】贵w，使用單克隆抗體的二抗，此時二抗的識別抗原免疫簇是唯一的，其非專一性的抗原-抗體相互作用會大為減少。當(dāng)然，有時，單克隆抗體也會有識別抗原免疫簇不唯一，如果兩種蛋白質(zhì)的抗原免疫簇的結(jié)構(gòu)很相近的話。如果不知道是不是二抗的識別抗原免疫簇不唯一，可以不加一抗的情況下只加二抗實(shí)驗(yàn)，可以檢測出是否為二抗的的抗原免疫簇的識別的原因，若是的話，可以先更換封閉試劑，若無效，則要同時更換二抗。 4.封閉不充分，增加封閉液的封閉時間，適當(dāng)提高溫度，更換封閉液。 5.曝光過度，縮短曝光時間。 6.檢測過程中膜干燥，保持充分的反應(yīng)液，避免膜干燥。 7．若無別的選擇，可嘗試選擇5%的脫脂奶粉，同時加入Tween=20。 8.滴定一抗或二抗的效價，找到一個產(chǎn)生清晰的信號強(qiáng)度可以接受的較低的抗體濃度。 9.縮短一抗和二抗的孵育時間。 |
8樓2014-07-18 10:58:04
神秘旅游2836
銅蟲 (初入文壇)
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