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thestormcong銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
RED基因敲除
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| 各位師兄師姐好，小弟最近想做red重組系統(tǒng)的基因敲除，現(xiàn)在在設(shè)計(jì)引物，查看了一些文獻(xiàn)，都說(shuō)鑒定引物需要設(shè)計(jì)在同源臂兩側(cè)，那為什么鑒定引物就不能設(shè)在同源臂上呢，我想設(shè)在同源臂上看看，這樣行嗎？還有各位師兄師姐都提供以下相關(guān)的經(jīng)驗(yàn)技術(shù)，因?yàn)橐郧耙矎膩?lái)沒(méi)做過(guò)這個(gè)，沒(méi)啥經(jīng)驗(yàn)?zāi)�。還有我要敲除的菌株沒(méi)有能夠查到其基因組序列，ncbi上沒(méi)有提交，而相近的一些菌株則有這個(gè)基因，這些基因比對(duì)了之后80-90%都是同源的，我能否直接根據(jù)相近的這些基因來(lái)設(shè)計(jì)引物呢，請(qǐng)求指教，非常感謝！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
★
1949stone(金幣+1): 同意 2011-11-25 23:14:25
1949stone(金幣+1): 同意 2011-11-25 23:14:25
| 可以 設(shè)計(jì)在兩側(cè) 只是為了證明重組的locus是正確的 依照你的情況 沒(méi)有確切的序列 而且如果設(shè)計(jì)在兩側(cè) 同源性可能連80-90%都沒(méi)有了 沒(méi)法設(shè)計(jì)引物 |
thestormcong2樓2011-11-25 22:33:54
srlee
鐵桿木蟲(chóng) (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
wanhscn(金幣+4): Good！熱心！專(zhuān)業(yè)！ 2011-11-26 20:36:08
thestormcong(金幣+5): 希望能夠得到指點(diǎn)。小弟還沒(méi)有相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，謝謝。 2011-11-27 12:09:14
wanhscn(MolEPI+1): 根據(jù)樓主反映，理應(yīng)授予專(zhuān)家指數(shù)！補(bǔ)上！ 2011-11-27 16:09:01
wanhscn(金幣+4): Good！熱心！專(zhuān)業(yè)！ 2011-11-26 20:36:08
thestormcong(金幣+5): 希望能夠得到指點(diǎn)。小弟還沒(méi)有相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，謝謝。 2011-11-27 12:09:14
wanhscn(MolEPI+1): 根據(jù)樓主反映，理應(yīng)授予專(zhuān)家指數(shù)！補(bǔ)上！ 2011-11-27 16:09:01
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1）設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物可以在兩側(cè)同源臂上，驗(yàn)證時(shí)突變株和野生型PCR條帶會(huì)有區(qū)別很容易看出來(lái)的！ 2）如果你要敲除的目的片段很長(zhǎng)大于5kb，那么驗(yàn)證時(shí)PCR不是很方面，當(dāng)然也可以設(shè)在你要敲出的目的片段上，如果是正確的突變株理論上是P不出來(lái)的，而野生型的能P出來(lái)！ 3）顯然不能依據(jù)其他基因的同源序列來(lái)設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物的，你可以根據(jù)這些同源序列設(shè)計(jì)一個(gè)兼并引物，篩選你的目的基因后再在你的目的基因的基礎(chǔ)上walking幾個(gè)反應(yīng)不就拿到你要的序列了嗎？ 祝實(shí)驗(yàn)順利！ |
3樓2011-11-26 15:15:45
thestormcong
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4樓2011-11-27 11:55:24
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5樓2011-11-27 12:07:07
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