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songxiaobop金蟲 (小有名氣)
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[求助]
3'RACE做了幾次，為什么老是這樣子，大家看一下幫幫忙吧，苦悶死了！~
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用的是TAKARA的盒子 這個(gè)是做巢式PCR的第一輪擴(kuò)增，似乎是又一條帶，然后就按照說明書的要求，取1微升做了第二輪擴(kuò)增，結(jié)果是這個(gè)樣子。 然后幾次做的都是下邊這樣的：  反轉(zhuǎn)錄體系中要求RNA的量是1微克，可是我感覺自己提的RNA濃度比較低，反轉(zhuǎn)錄體系是10微升的，怎樣保證反轉(zhuǎn)錄的效果，怎樣檢測？ 巢式擴(kuò)增是不是按照說明書上的50微升體系比較好？ 這樣的結(jié)果應(yīng)該怎樣調(diào)整一下體系？ 快畢業(yè)了，很是著急苦悶啊 。 求大家?guī)蛶兔Γ?br /> [ 來自科研家族 深海家族 ] |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
wanhscn(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助！whs 2011-12-07 11:43:58
songxiaobop(金幣+2): 2011-12-19 08:42:46
wanhscn(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助！whs 2011-12-07 11:43:58
songxiaobop(金幣+2): 2011-12-19 08:42:46
| 最好是每做一步都做檢測，提取RNA后檢測RNA的完整性，如果質(zhì)量不好，RACE很難出結(jié)果。一般來說3RACE相對容易做，建議多設(shè)計(jì)幾條RACE引物，一般來說擴(kuò)增出來的條帶全部回收后測序（一條帶很可能不是我們感興趣的），當(dāng)然大部分是無用的序列，可能只有十分之一二才是目的序列。做RACE是個(gè)很熬人的活，我最近做了7個(gè)基因的RACE,設(shè)計(jì)了50多條RACE引物，做了三四輪RACE,回收片段多達(dá)120多個(gè)，全部做了TA克隆，測序不下200個(gè)樣，到目前為止6個(gè)基因是擴(kuò)增到全長了，其中一個(gè)還是沒有拿到目的片段，打算放棄了。做RACE是個(gè)體力活，依個(gè)人經(jīng)驗(yàn)來看，回收一兩個(gè)片段就能得到感興趣的基因是不可能的。 |
4樓2011-12-06 23:43:19
shaquila
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5樓2011-12-07 10:00:36
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9樓2011-12-07 22:28:46
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10樓2011-12-08 22:22:46
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