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音四1990

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[求助] RACE產(chǎn)物太少，結(jié)果很差，求分析體系已有1人參與

RACE本來好好的突然出不來東西了小生好郁悶……求各路大神指點(diǎn)迷津�。�

從上學(xué)到現(xiàn)在，斷斷續(xù)續(xù)做著RACE，3‘RACE和5’RACE一起做。
用superswitch的試劑盒和里面的引物在RNA上加帽子結(jié)構(gòu)和Poly（A）尾，對(duì)應(yīng)的3、5端引物也是試劑盒里AP，基因特異性引物是根據(jù)核心序列設(shè)計(jì)好的。總共設(shè)計(jì)了三對(duì)引物好做nest。

之前3‘和5’都有了比較好的結(jié)果，3‘的1p產(chǎn)物回收后，分別用另外兩個(gè)引物做了nest，得到的條帶大小比較后，有三條不同大小的帶都符合。
$\"RACE產(chǎn)物太少，結(jié)果很差，求分析體系\"$
上圖是5’的2p，感覺特別好，但是反應(yīng)液用TAKARA的試劑盒回收后就出問題了，電泳跑出來沒東西，后續(xù)的PCR也做不出來。
$\"RACE產(chǎn)物太少，結(jié)果很差，求分析體系-1\"$
上圖是3‘RACE的圖，比較不同引物的nest結(jié)果，能看出哪些帶是目的條帶，同樣的體系再重新跑，出來的圖就完全不是這樣了，什么都沒有T T

為了切膠克隆再繼續(xù)做，用同樣的模板、引物、體系，卻只有很淡很淡的條帶甚至是沒有，改變模板用量、引物用量、25和50ul都跑了，也用了TouchDown和之前的PCR條件，無論如何都出不來之前的條帶。
5’的1p跑完后再跑nest，考慮到3‘的情況，模板做了2X、5X、10X的稀釋，加0.5ul，引物用量做了0.1ul、0.2ul、0.5ul和1ul的調(diào)整，5X稀釋的模板，引物0.5ul和1ul的，有產(chǎn)物，條帶也比較亮，非特異性條帶不多。
$\"RACE產(chǎn)物太少，結(jié)果很差，求分析體系-2\"$
但是RACE的那個(gè)引物真的好貴……就那么一丁點(diǎn)，每次加1ul的話5次就用完了……所以我還是用了0.1ul的引物，結(jié)果產(chǎn)物量非常少，模板還是5X稀釋的，但跑出來幾乎都在加樣孔里，加樣孔亮亮的下面什么都沒有……感覺根本就沒有進(jìn)行PCR。

于是現(xiàn)在反復(fù)的做著RACE浪費(fèi)著引物和酶，重復(fù)之前的條件，出來的圖都是一個(gè)樣：加樣孔亮，有抹帶，有時(shí)候拖帶還很嚴(yán)重，預(yù)計(jì)的條帶很淡，完全沒辦法進(jìn)行切膠回收。
甚至那個(gè)圖就跟瀑布一樣……
$\"RACE產(chǎn)物太少，結(jié)果很差，求分析體系-3\"$
$\"RACE產(chǎn)物太少，結(jié)果很差，求分析體系-4\"$

$\"RACE產(chǎn)物太少，結(jié)果很差，求分析體系-6\"$
希望跑RACE成功的大神幫忙分析一下，問題可能出在哪里。
我的RNA因?yàn)榉崔D(zhuǎn)過好幾次，反復(fù)凍融過，所以我想會(huì)不會(huì)根本就是RNA質(zhì)量差導(dǎo)致cDNA反轉(zhuǎn)的一步就沒做好。
酶和Buffer沒有問題，引物會(huì)不會(huì)也降解呢？后期失敗的PCR，跑出來的圖基本都沒有引物二聚體在下面。
在RACE過程中引物的量影響有多大呢？這種引物實(shí)在是貴……而且人家試劑盒里的引物我又沒辦法自己合成，所以只能省著用不能加多啊，會(huì)不會(huì)真的是引物太少導(dǎo)致的呢？
PCR程序用的是58度退火30s、72度延伸2m30s，之前能跑出東西，但是非特異條帶有點(diǎn)多，用了TouchDown，68~55每循環(huán)數(shù)降0.5和每循環(huán)降2，每個(gè)溫度3個(gè)循環(huán)兩種程序，都沒東西，

我都混亂了……
因?yàn)榫臀易约涸谧鯮ACE別人都不做，所以只能向論壇里各位大神請(qǐng)教了……有經(jīng)驗(yàn)的大神們快來拯救小生……T T

20140306-5'RACE-2p-2.jpg

20140306-5'RACE-2p-2.jpg

20140309-race-1P回收為模板的3'2P+3P-5.jpg

20140316-race-3.jpg

20140321-5'RACE-5R2-4.jpg

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我沒那種命啊輪也不會(huì)輪到我

1樓 2014-04-08 20:51:06

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 鼓勵(lì)交流 2014-04-09 11:08:16
音四1990: 金幣+20, ★★★很有幫助 2014-04-12 10:05:01

貌似模板濃度高了

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2樓2014-04-08 21:58:40

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2樓: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-08 21:58:40
貌似模板濃度高了

但是稀釋后沒有拖帶也沒有產(chǎn)物

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我沒那種命啊輪也不會(huì)輪到我

3樓2014-04-09 08:41:55

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3樓: Originally posted by 音四1990 at 2014-04-09 08:41:55
但是稀釋后沒有拖帶也沒有產(chǎn)物...

那要看你第一輪怎么跑的，降落式肯定不OK，稀釋也是看模板濃度來的，要把握好那個(gè)度有點(diǎn)難

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4樓2014-04-09 12:16:39

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4樓: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-09 12:16:39
那要看你第一輪怎么跑的，降落式肯定不OK，稀釋也是看模板濃度來的，要把握好那個(gè)度有點(diǎn)難
...

第一輪不用降落第一輪按照之前做梯度做出來的退火溫度跑的一個(gè)成功率比較高的程序
我的圖出來產(chǎn)物量都不算很高的我始終懷疑是我反應(yīng)液回收過程中有問題打算換一種試劑盒

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5樓2014-04-10 21:48:52

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5樓: Originally posted by 音四1990 at 2014-04-10 21:48:52
第一輪不用降落第一輪按照之前做梯度做出來的退火溫度跑的一個(gè)成功率比較高的程序
我的圖出來產(chǎn)物量都不算很高的我始終懷疑是我反應(yīng)液回收過程中有問題打算換一種試劑盒...

你可能還是沒有理解race最核心的原理

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6樓2014-04-10 22:22:15

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6樓: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-10 22:22:15
你可能還是沒有理解race最核心的原理
...

我覺得我連PCR原理都不太清楚……T T

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7樓2014-04-11 16:33:43

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7樓: Originally posted by 音四1990 at 2014-04-11 16:33:43
我覺得我連PCR原理都不太清楚……T T...

can i help u?

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8樓2014-04-12 12:33:26

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8樓: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-12 12:33:26
can i help u?
...

that will be so nice~
其實(shí)原理啊那些我反復(fù)看了很多資料的主要是沒有生化基礎(chǔ) 咱跨專業(yè)過來的……基礎(chǔ)不好在這種時(shí)候就只能慢慢摸索

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9樓2014-04-12 15:24:33

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9樓: Originally posted by 音四1990 at 2014-04-12 15:24:33
that will be so nice~
其實(shí)原理啊那些我反復(fù)看了很多資料的主要是沒有生化基礎(chǔ) 咱跨專業(yè)過來的……基礎(chǔ)不好在這種時(shí)候就只能慢慢摸索...

關(guān)鍵是理解RACE過程中基因富集的原理，懂了，怎么做怎么OK

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10樓2014-04-12 17:03:07

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