 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2624 | 回復(fù): 13 | ||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | ||
音四1990鐵蟲 (小有名氣)
|
[求助]
RACE產(chǎn)物太少，結(jié)果很差，求分析體系 已有1人參與
|
|
|
RACE本來好好的突然出不來東西了小生好郁悶……求各路大神指點(diǎn)迷津��！ 從上學(xué)到現(xiàn)在，斷斷續(xù)續(xù)做著RACE，3‘RACE和5’RACE一起做。 用superswitch的試劑盒和里面的引物在RNA上加帽子結(jié)構(gòu)和Poly（A）尾，對(duì)應(yīng)的3、5端引物也是試劑盒里AP，基因特異性引物是根據(jù)核心序列設(shè)計(jì)好的�？偣苍O(shè)計(jì)了三對(duì)引物好做nest。 之前3‘和5’都有了比較好的結(jié)果，3‘的1p產(chǎn)物回收后，分別用另外兩個(gè)引物做了nest，得到的條帶大小比較后，有三條不同大小的帶都符合。 ![\"RACE產(chǎn)物太少](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2014/0408/w159h2844397_1396961600_464.jpg#opennewwindow\") 上圖是5’的2p，感覺特別好，但是反應(yīng)液用TAKARA的試劑盒回收后就出問題了，電泳跑出來沒東西，后續(xù)的PCR也做不出來。 ![\"RACE產(chǎn)物太少，結(jié)果很差](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2014/0408/w86h2844397_1396961866_352.jpg#opennewwindow\") 上圖是3‘RACE的圖，比較不同引物的nest結(jié)果，能看出哪些帶是目的條帶，同樣的體系再重新跑，出來的圖就完全不是這樣了，什么都沒有T T 為了切膠克隆再繼續(xù)做，用同樣的模板、引物、體系，卻只有很淡很淡的條帶甚至是沒有，改變模板用量、引物用量、25和50ul都跑了，也用了TouchDown和之前的PCR條件，無論如何都出不來之前的條帶。 5’的1p跑完后再跑nest，考慮到3‘的情況，模板做了2X、5X、10X的稀釋，加0.5ul，引物用量做了0.1ul、0.2ul、0.5ul和1ul的調(diào)整，5X稀釋的模板，引物0.5ul和1ul的，有產(chǎn)物，條帶也比較亮，非特異性條帶不多。 ![\"RACE產(chǎn)物太少](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2014/0408/w124h2844397_1396961867_678.jpg#opennewwindow\") 但是RACE的那個(gè)引物真的好貴……就那么一丁點(diǎn)，每次加1ul的話5次就用完了……所以我還是用了0.1ul的引物，結(jié)果產(chǎn)物量非常少，模板還是5X稀釋的，但跑出來幾乎都在加樣孔里，加樣孔亮亮的下面什么都沒有……感覺根本就沒有進(jìn)行PCR。 于是現(xiàn)在反復(fù)的做著RACE浪費(fèi)著引物和酶，重復(fù)之前的條件，出來的圖都是一個(gè)樣：加樣孔亮，有抹帶，有時(shí)候拖帶還很嚴(yán)重，預(yù)計(jì)的條帶很淡，完全沒辦法進(jìn)行切膠回收。 甚至那個(gè)圖就跟瀑布一樣…… ![\"RACE產(chǎn)物太少](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2014/0408/w134h2844397_1396961867_702.jpg#opennewwindow\") ![\"RACE產(chǎn)物太少](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2014/0408/w245h2844397_1396961866_996.jpg#opennewwindow\") ![\"RACE產(chǎn)物太少](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2014/0408/w245h2844397_1396962201_227.jpg#opennewwindow\") 希望跑RACE成功的大神幫忙分析一下，問題可能出在哪里。 我的RNA因?yàn)榉崔D(zhuǎn)過好幾次，反復(fù)凍融過，所以我想會(huì)不會(huì)根本就是RNA質(zhì)量差導(dǎo)致cDNA反轉(zhuǎn)的一步就沒做好。 酶和Buffer沒有問題，引物會(huì)不會(huì)也降解呢？后期失敗的PCR，跑出來的圖基本都沒有引物二聚體在下面。 在RACE過程中引物的量影響有多大呢？這種引物實(shí)在是貴……而且人家試劑盒里的引物我又沒辦法自己合成，所以只能省著用不能加多啊，會(huì)不會(huì)真的是引物太少導(dǎo)致的呢？ PCR程序用的是58度退火30s、72度延伸2m30s，之前能跑出東西，但是非特異條帶有點(diǎn)多，用了TouchDown，68~55每循環(huán)數(shù)降0.5和每循環(huán)降2，每個(gè)溫度3個(gè)循環(huán)兩種程序，都沒東西， 我都混亂了…… 因?yàn)榫臀易约涸谧鯮ACE別人都不做，所以只能向論壇里各位大神請(qǐng)教了……有經(jīng)驗(yàn)的大神們快來拯救小生……T T 20140306-5'RACE-2p-2.jpg 20140306-5'RACE-2p-2.jpg 20140309-race-1P回收為模板的3'2P+3P-5.jpg 20140316-race-3.jpg 20140321-5'RACE-5R2-4.jpg |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有161人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有15人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 求翻譯一句英文，我的語法很差，請(qǐng)指出該句涉及的主要語法點(diǎn)
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 氣相中甲醇出峰峰形很差
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 關(guān)于3' RACE 測序結(jié)果分析。
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 測序結(jié)果分析，以及RACE引物設(shè)計(jì)。求助呢
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 仲醇和酰氯反應(yīng)，三乙胺為縛酸劑，結(jié)果顯示酰氯與三乙胺反應(yīng)，卻沒有與醇反應(yīng)！
已經(jīng)有35人回復(fù)
- 細(xì)菌總DNA電泳圖譜分析
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 【求助】動(dòng)態(tài)光散射法測定天然膠乳的粒徑及分布
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】為什么條帶很細(xì)�。坑魫�?zāi)兀?/a>
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 【求助/交流】pcr結(jié)果電泳條帶很淡
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 【求助】氣相檢測樣品時(shí) 出峰很差，拖尾峰很嚴(yán)重？
已經(jīng)有3人回復(fù)
音四1990
鐵蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 221.1
- 帖子: 63
- 在線: 13.9小時(shí)
- 蟲號(hào): 2844397
- 注冊(cè): 2013-12-03
- 性別: MM
- 專業(yè): 獸醫(yī)免疫學(xué)
3樓2014-04-09 08:41:55
Neo2000
木蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 639 (博士)
- 金幣: 8720.2
- 紅花: 37
- 帖子: 1700
- 在線: 269.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 322365
- 注冊(cè): 2007-03-11
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
2樓2014-04-08 21:58:40
Neo2000
木蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 639 (博士)
- 金幣: 8720.2
- 紅花: 37
- 帖子: 1700
- 在線: 269.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 322365
- 注冊(cè): 2007-03-11
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
4樓2014-04-09 12:16:39
音四1990
鐵蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 221.1
- 帖子: 63
- 在線: 13.9小時(shí)
- 蟲號(hào): 2844397
- 注冊(cè): 2013-12-03
- 性別: MM
- 專業(yè): 獸醫(yī)免疫學(xué)
5樓2014-04-10 21:48:52
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 求調(diào)劑 +6 | 白QF 2026-03-21 | 7/350 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 083000學(xué)碩274求調(diào)劑 +5 | Li李魚 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 285求調(diào)劑 +4 | AZMK 2026-03-27 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 化學(xué)調(diào)劑 +4 | 愛吃番茄的旭 2026-03-24 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 322求調(diào)劑 +4 | 舊吢 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +6 | 墨墨漠 2026-03-27 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 348求調(diào)劑 +4 | 小懶蟲不懶了 2026-03-27 | 5/250 |
|
|
|
[碩博家園] 招收生物學(xué)/細(xì)胞生物學(xué)調(diào)劑 +3 | IceGuo 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 284求調(diào)劑 +11 | junqihahaha 2026-03-26 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 327求調(diào)劑 +7 | prayer13 2026-03-23 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +6 | Koxui 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 尋找調(diào)劑 +5 | 倔強(qiáng)芒? 2026-03-21 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 291 求調(diào)劑 +7 | 化工2026屆畢業(yè)?/a> 2026-03-21 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 生物技術(shù)與工程 +3 | 1294608413 2026-03-25 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 各位老師您好：本人初試372分 +5 | jj涌77 2026-03-25 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +3 | 冬十三 2026-03-24 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿北化315 求調(diào)劑 +3 | akrrain 2026-03-24 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 305分求調(diào)劑（食品工程） +5 | Sxy112 2026-03-21 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 工科0856求調(diào)劑 +5 | 沐析汀汀 2026-03-21 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 070300，一志愿北航320求調(diào)劑 +3 | Jerry0216 2026-03-22 | 5/250 |
|