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音四1990鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
RACE產(chǎn)物太少，結(jié)果很差，求分析體系 已有1人參與
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RACE本來好好的突然出不來東西了小生好郁悶……求各路大神指點迷津��！ 從上學(xué)到現(xiàn)在，斷斷續(xù)續(xù)做著RACE，3‘RACE和5’RACE一起做。 用superswitch的試劑盒和里面的引物在RNA上加帽子結(jié)構(gòu)和Poly（A）尾，對應(yīng)的3、5端引物也是試劑盒里AP，基因特異性引物是根據(jù)核心序列設(shè)計好的。總共設(shè)計了三對引物好做nest。 之前3‘和5’都有了比較好的結(jié)果，3‘的1p產(chǎn)物回收后，分別用另外兩個引物做了nest，得到的條帶大小比較后，有三條不同大小的帶都符合。 ![\"RACE產(chǎn)物太少](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2014/0408/w159h2844397_1396961600_464.jpg#opennewwindow\") 上圖是5’的2p，感覺特別好，但是反應(yīng)液用TAKARA的試劑盒回收后就出問題了，電泳跑出來沒東西，后續(xù)的PCR也做不出來。 ![\"RACE產(chǎn)物太少](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2014/0408/w86h2844397_1396961866_352.jpg#opennewwindow\") 上圖是3‘RACE的圖，比較不同引物的nest結(jié)果，能看出哪些帶是目的條帶，同樣的體系再重新跑，出來的圖就完全不是這樣了，什么都沒有T T 為了切膠克隆再繼續(xù)做，用同樣的模板、引物、體系，卻只有很淡很淡的條帶甚至是沒有，改變模板用量、引物用量、25和50ul都跑了，也用了TouchDown和之前的PCR條件，無論如何都出不來之前的條帶。 5’的1p跑完后再跑nest，考慮到3‘的情況，模板做了2X、5X、10X的稀釋，加0.5ul，引物用量做了0.1ul、0.2ul、0.5ul和1ul的調(diào)整，5X稀釋的模板，引物0.5ul和1ul的，有產(chǎn)物，條帶也比較亮，非特異性條帶不多。 ![\"RACE產(chǎn)物太少](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2014/0408/w124h2844397_1396961867_678.jpg#opennewwindow\") 但是RACE的那個引物真的好貴……就那么一丁點，每次加1ul的話5次就用完了……所以我還是用了0.1ul的引物，結(jié)果產(chǎn)物量非常少，模板還是5X稀釋的，但跑出來幾乎都在加樣孔里，加樣孔亮亮的下面什么都沒有……感覺根本就沒有進行PCR。 于是現(xiàn)在反復(fù)的做著RACE浪費著引物和酶，重復(fù)之前的條件，出來的圖都是一個樣：加樣孔亮，有抹帶，有時候拖帶還很嚴(yán)重，預(yù)計的條帶很淡，完全沒辦法進行切膠回收。 甚至那個圖就跟瀑布一樣…… ![\"RACE產(chǎn)物太少](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2014/0408/w134h2844397_1396961867_702.jpg#opennewwindow\") ![\"RACE產(chǎn)物太少，結(jié)果很差](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2014/0408/w245h2844397_1396961866_996.jpg#opennewwindow\") ![\"RACE產(chǎn)物太少](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2014/0408/w245h2844397_1396962201_227.jpg#opennewwindow\") 希望跑RACE成功的大神幫忙分析一下，問題可能出在哪里。 我的RNA因為反轉(zhuǎn)過好幾次，反復(fù)凍融過，所以我想會不會根本就是RNA質(zhì)量差導(dǎo)致cDNA反轉(zhuǎn)的一步就沒做好。 酶和Buffer沒有問題，引物會不會也降解呢？后期失敗的PCR，跑出來的圖基本都沒有引物二聚體在下面。 在RACE過程中引物的量影響有多大呢？這種引物實在是貴……而且人家試劑盒里的引物我又沒辦法自己合成，所以只能省著用不能加多啊，會不會真的是引物太少導(dǎo)致的呢？ PCR程序用的是58度退火30s、72度延伸2m30s，之前能跑出東西，但是非特異條帶有點多，用了TouchDown，68~55每循環(huán)數(shù)降0.5和每循環(huán)降2，每個溫度3個循環(huán)兩種程序，都沒東西， 我都混亂了…… 因為就我自己在做RACE別人都不做，所以只能向論壇里各位大神請教了……有經(jīng)驗的大神們快來拯救小生……T T 20140306-5'RACE-2p-2.jpg 20140306-5'RACE-2p-2.jpg 20140309-race-1P回收為模板的3'2P+3P-5.jpg 20140316-race-3.jpg 20140321-5'RACE-5R2-4.jpg |
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