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tuodecai鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[求助]
求體外轉(zhuǎn)錄 已有2人參與
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我這體外轉(zhuǎn)錄斷斷續(xù)續(xù)做了近一年了，已經(jīng)用了兩個(gè)試劑盒，第一個(gè)是ambion公司的mMESSAGE mMACHINE Kit High Yield Capped RNA Transcription Kit，剛買(mǎi)了第二個(gè)試劑盒（Promega公司的RiboMAX Large Scale RNA Production Systems—SP6 and T7），做了幾次仍未成功，但每次試劑盒里的對(duì)照都能轉(zhuǎn)成功的。我的實(shí)驗(yàn)是要轉(zhuǎn)錄出一條11kb的病毒基因組RNA，用帶T7啟動(dòng)子的PCR的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。我覺(jué)得體外轉(zhuǎn)錄的模板應(yīng)該比較關(guān)鍵，不知是不需要做什么特殊的處理？也許是因?yàn)槠屋^大，我每次PCR產(chǎn)物回收后的濃度(50ng/ul)遠(yuǎn)達(dá)不到試劑盒里的濃度（第一個(gè)kit要求1ug/ul，第二個(gè)要求5-10ug的性線化模板量），而我也用乙醇沉淀后，效果同樣不理想。請(qǐng)有體外轉(zhuǎn)錄經(jīng)驗(yàn)的高手支招，多多交流下下您們的經(jīng)驗(yàn)，看看做體外轉(zhuǎn)錄最需要注意的是哪些方面。不盡感激！ [ Last edited by 1949stone on 2011-12-20 at 13:28 ] |
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