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wapw1987新蟲 (小有名氣)
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[求助]
gst標簽蛋白的表達和純化
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| 有沒有高人做過GST標簽的蛋白的表達和純化，能不能給點建議，我用的是pGEX質粒，需要在什么菌株中表達，純化時用什么方法收集提純呢？ |
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
wapw1987: 回帖置頂 2011-12-25 15:12:27
wapw1987(金幣+2): ★★★★★最佳答案 2011-12-25 15:31:24
linyingjia(金幣+5, BioEPI+1, 專家考核): 很好 2011-12-27 20:30:24
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linyingjia(金幣+5, BioEPI+1, 專家考核): 很好 2011-12-27 20:30:24
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1. 轉8ml過夜小搖菌液接入800ml含氨芐的LB培養(yǎng)基（2L錐形瓶）, 37度搖菌至OD600至 0.6。 2. 誘導前取1ml菌液，也可使用轉入其它質粒的未誘導的BI21菌株作對照。 這是沒有誘導的對照，5000rpm，5min去上清，菌體用50 μl SDS loading buffer重懸，放置于－20度備用。 3. 加IPTG誘導蛋白表達，使其中濃度達0.1mM。 4. 室溫誘導過夜（8小時左右），取1ml菌液。 這是誘導后的對照，5000rpm，5min去上清，菌體用100μl SDS loading buffer重懸，放置于－20度備用。 5. 使用冷凍離心機4000g，4度離心20分鐘，去上清。（除去LB培養(yǎng)基） 6. 將-20度保存的菌體放在冰上15min，用lysis buffer重懸。（1g菌體用2到5ml lysis buffer） 7. 加溶菌酶，使其終濃度達1mg/ml，放置于冰上30min。 8. 超聲破碎細胞（冰上進行），工作2s停1s，60s每循環(huán)，重復四次。 9. 10000g，4度離心30min。 11. 從上清中取出20μl，加5μl SDS loading buffer，放置于－20度備用。 Beads的預處理： 1） 將600μl 50％的Ni-NTA slurry/ Glutation Sepharose 4B加入層析柱，打開底部的的蓋子，除去酒精。 2） 4ml 無菌水洗柱3－4次（間隔：4度 rotate10min） 3） Lysis buffer 洗柱2次（同上） 12. 將剩余裂解液加0.3ml beads，4度冰箱rotate 2hr。 13. 裝柱 14. 用4ml Wash buffer洗beads（目的是洗掉非特異吸附），4度冰箱rotate 10min，重復洗四次，最后一次離心留少許上清。（因為有可能beads對融合蛋白的結合不強，所以每一步都保留上清） 每次洗脫都要取20 μl，加5μl 5*SDS loading buffer。放置于－20度備用。 15. 使用300μl Elution buffer洗柱（可根據(jù)情況，適量增加洗脫體積），4度冰箱rotate 10min，重復洗四次，每次都用一個EP管接收。分析每次洗脫的蛋白量，實驗要在冰上進行。 每次洗脫都要取5μl，加5μl 2*SDS loading buffer，放置于－20度備用。 16. 10％SDS PAGE檢測。 17. 檢測蛋白濃度 |
4樓2011-12-25 01:02:41
Dionysius
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9樓2011-12-30 09:38:30
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