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湘云紫

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[交流] 心肌細(xì)胞培養(yǎng)交流

以下是我的實(shí)驗(yàn)步驟
1. 2-4天大鼠乳鼠酒精浸泡15秒，取心，置于有4度pbs的培養(yǎng)皿中，用pbs清洗2遍
2. 剔除心臟周圍的血凝及纖維組織，抽取5ml胰酶，少量放入50ml燒杯中，大部分（留點(diǎn)沖洗）倒入50ml離心管，將心臟放入小燒杯剪碎，倒入50ml離心管，用剩余的胰酶沖洗一遍。
3. 消化：將含有心肌的50ml的離心管放入34℃的水浴鍋中10min，輕輕晃動(dòng)數(shù)次。第一次消化液棄去。以后消化為8分鐘（中間搖晃幾次）。
4. 離心：補(bǔ)加3ml 胰酶入2步驟中的離心管，繼續(xù)消化。第二次以后的消化液輕輕吹打，自然沉淀，各取2ml上清放入2 只（1,2號(hào)）離心管，再各加入2mlDMEM離心8分鐘（1000轉(zhuǎn)）。離心好的1,2號(hào)離心管，棄上清，加1mlDMEM重懸，收集于一只15ml離心管中。
5. 重復(fù)消化和離心。將所有離心過(guò)的細(xì)胞重懸后收集于離心管，再次離心8分鐘，棄上清，加入含有20%胎牛血清、雙抗、brdu的DMEM 4ml，重懸，過(guò)100、200目不銹鋼篩網(wǎng)。
6. 過(guò)篩后的細(xì)胞液放入細(xì)胞瓶，90min差數(shù)貼壁。調(diào)整細(xì)胞濃度500000個(gè)每毫升。種于24孔板中。我6只大鼠乳鼠心臟種了6孔。24小時(shí)換液，此后隔日換液。

結(jié)果：
離心后細(xì)胞數(shù)目較多，細(xì)胞小而圓。
24小時(shí)換液后，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，貼壁細(xì)胞稀疏，小而圓，部分會(huì)抖動(dòng)。
48小時(shí)觀察，細(xì)胞小，量少，不動(dòng)

交流：
第一次換液，48小時(shí)會(huì)不會(huì)好一點(diǎn)？
我的細(xì)胞24小時(shí)的時(shí)候都是圓的是怎么回事？
有沒(méi)有哪位高人有成熟的心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法？？
膠原酶好貴啊。。真心用不起誒。。�？�。。。

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1樓 2011-12-30 20:48:49

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你的培養(yǎng)基都加哪些東西��？除了雙抗和血清需要加非必須氨基酸和谷氨酰胺么？

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4樓2012-11-21 16:43:02

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重陽(yáng)節(jié)節(jié)

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yqbter: 金幣+1, 鼓勵(lì)發(fā)帖！ 2012-06-24 01:29:19

你這到最后一步才終止消化，細(xì)胞早就被消化死了。在離心以前就要加入胎牛血清，終止消化。你的操作有太多的問(wèn)題，建議多看一點(diǎn)關(guān)于心肌細(xì)胞培養(yǎng)的文章。

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3樓2012-06-23 19:00:45

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幾音

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胰酶消化那么長(zhǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞損傷會(huì)很大吧，另外24小時(shí)換培養(yǎng)液是不是早了點(diǎn)？導(dǎo)致很多心肌細(xì)胞隨著換液流失。

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5樓2013-03-19 10:21:14

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liboliu2007

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我用的MP的膠原酶100mg粉末不到300塊，能配好多啊。
此外樓主用的血清要好一些的啊，最好加用促生長(zhǎng)因子。養(yǎng)原代心肌細(xì)胞就是噩夢(mèng)。

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6樓2014-04-21 10:33:54

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湘云紫2樓

2011-12-30 20:54 回復(fù)

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