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majunyang銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
蛋白純化遇到問題
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| 從野生菌里純化不同蛋白酶組分，發(fā)酵液過陰離子柱，穿透峰里檢測有酶活，7-56ms/cm電導(dǎo)下也有酶活，流速3ML/min，跑蛋白電泳不能確定是不是同一個組分，又過陽離子柱，還是出現(xiàn)在穿透峰里，洗脫峰居然沒有，怎么回事？？？？？？謝謝��！ |
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13樓2012-01-05 00:51:47
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zhang8826857(金幣+5): 鼓勵應(yīng)助 2012-01-06 08:41:19
zhang8826857(金幣+5): 鼓勵應(yīng)助 2012-01-06 08:41:19
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無論是陰陽離子交換層析柱都要求目的蛋白質(zhì)的pI與所使用的pH體系相差1個單位，但對于自己從沒有純化過的一個蛋白質(zhì)來說，pI是未知的，如果用粗酶來測定pI又不夠準(zhǔn)確。其實(shí)沒必要測定pI，只要做一個預(yù)備實(shí)驗(yàn)就可以知道應(yīng)該使用什么樣的pH值緩沖體系：如果有AKTA純化儀，就使用一根CV=1ml 的層析柱（陰陽層析柱都要做這個預(yù)備實(shí)驗(yàn)）來吸附蛋白質(zhì)，收集流穿，然后用1M氯化鈉清洗層析柱并收集，這樣的兩個組分哪個含有你的酶，就知道起碼要多少的pH值才能吸附你的酶了。 千萬要注意用離子交換層析柱的樣品所含鹽濃度要低，鹽析之后的沉淀含有鹽，不能直接用離子交換層析柱來分離，最好是用G25脫鹽柱來脫鹽，最不濟(jì)也要透析除鹽。 7-56ms/cm是較低的電導(dǎo)，也有酶活說明是pH選擇不當(dāng)，不是樣品里含鹽多，如果是含鹽多，則電導(dǎo)率會高。 在蛋白質(zhì)能被牢牢吸附的情況下，3ml/min不算高，我使用CV=1ML的層析柱時也使用1ml/min，沒問題。 分子篩的先決條件是目的蛋白質(zhì)與雜質(zhì)蛋白質(zhì)分子量相差起碼為1倍，但是蛋白酶分子量不會太小，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)都處于30-80KD之間，分不開的。 |
14樓2012-01-06 08:29:51
majunyang
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