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majunyang銀蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
蛋白純化遇到問(wèn)題
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| 從野生菌里純化不同蛋白酶組分，發(fā)酵液過(guò)陰離子柱，穿透峰里檢測(cè)有酶活，7-56ms/cm電導(dǎo)下也有酶活，流速3ML/min，跑蛋白電泳不能確定是不是同一個(gè)組分，又過(guò)陽(yáng)離子柱，還是出現(xiàn)在穿透峰里，洗脫峰居然沒(méi)有，怎么回事？？？？？？謝謝！！ |
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10樓2012-01-02 23:17:38
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13樓2012-01-05 00:51:47
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zhang8826857(金幣+5): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-01-06 08:41:19
zhang8826857(金幣+5): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-01-06 08:41:19
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無(wú)論是陰陽(yáng)離子交換層析柱都要求目的蛋白質(zhì)的pI與所使用的pH體系相差1個(gè)單位，但對(duì)于自己從沒(méi)有純化過(guò)的一個(gè)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，pI是未知的，如果用粗酶來(lái)測(cè)定pI又不夠準(zhǔn)確。其實(shí)沒(méi)必要測(cè)定pI，只要做一個(gè)預(yù)備實(shí)驗(yàn)就可以知道應(yīng)該使用什么樣的pH值緩沖體系：如果有AKTA純化儀，就使用一根CV=1ml 的層析柱（陰陽(yáng)層析柱都要做這個(gè)預(yù)備實(shí)驗(yàn)）來(lái)吸附蛋白質(zhì)，收集流穿，然后用1M氯化鈉清洗層析柱并收集，這樣的兩個(gè)組分哪個(gè)含有你的酶，就知道起碼要多少的pH值才能吸附你的酶了。 千萬(wàn)要注意用離子交換層析柱的樣品所含鹽濃度要低，鹽析之后的沉淀含有鹽，不能直接用離子交換層析柱來(lái)分離，最好是用G25脫鹽柱來(lái)脫鹽，最不濟(jì)也要透析除鹽。 7-56ms/cm是較低的電導(dǎo)，也有酶活說(shuō)明是pH選擇不當(dāng)，不是樣品里含鹽多，如果是含鹽多，則電導(dǎo)率會(huì)高。 在蛋白質(zhì)能被牢牢吸附的情況下，3ml/min不算高，我使用CV=1ML的層析柱時(shí)也使用1ml/min，沒(méi)問(wèn)題。 分子篩的先決條件是目的蛋白質(zhì)與雜質(zhì)蛋白質(zhì)分子量相差起碼為1倍，但是蛋白酶分子量不會(huì)太小，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)都處于30-80KD之間，分不開(kāi)的。 |
14樓2012-01-06 08:29:51
majunyang
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