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XLJ海闊天空金蟲 (小有名氣)
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[求助]
急救�。�！關(guān)于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的一些問題
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蟲友們好! 我i是做的苜蓿的轉(zhuǎn)基因，遇見以下問題，請(qǐng)各位朋友幫助，馬上就該畢業(yè)了，轉(zhuǎn)基因還是沒長(zhǎng)出來，急死了！實(shí)驗(yàn)室之前沒人做過這方面的，急需您的指點(diǎn)�。�！ 1、再生體系已經(jīng)建立，成功獲得再生植株。然后我就按照再生體系的培養(yǎng)基配方來做轉(zhuǎn)化。自己認(rèn)為理論上用相同的培養(yǎng)基肯定應(yīng)該可以轉(zhuǎn)化出苗的，但是一直沒有結(jié)果。我的這種假設(shè)是錯(cuò)誤的嗎？ 2、在農(nóng)桿菌侵染過后，外植體形成胚性愈傷較難，加卡納篩選后很多都褐化，或者發(fā)黃。有的前期看著狀態(tài)蠻好，但是繼代一次，愈傷就變的疏松，沒有內(nèi)核，不知道是什么緣故？ 3、相同的品種、相同的部位的外植體，培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件什么的全都相同，但是在預(yù)培養(yǎng)3天后，有的下胚軸愈傷啟動(dòng)，但是有的發(fā)褐，這種情況在我篩選合適的細(xì)胞分裂素濃度和生長(zhǎng)素濃度時(shí)也屢次出現(xiàn)。不知道是什么原因，難道外植體本身個(gè)體差異那么大？ 4、在看不同抗生素濃度對(duì)愈傷形成及生長(zhǎng)的影響時(shí)，抗生素600mg/l時(shí)居然比抗生素濃度200mg/l的愈傷長(zhǎng)勢(shì)還好？每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)的話，都會(huì)有一個(gè)愈傷一個(gè)也不長(zhǎng)，發(fā)黃，沒反應(yīng)了，郁悶，篩選不出來結(jié)果 請(qǐng)指教，萬分感謝！�。� |
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lw19850128
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
jhu132llh(金幣+4, APEPI+1): 鼓勵(lì)積極分享 2012-01-06 16:45:05
XLJ海闊天空(金幣+1): ★★★★★最佳答案 非常感謝您耐心詳細(xì)的解答，非常感謝您！ 2012-01-06 20:08:30
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先簡(jiǎn)單回答下你的問題： 1，理論上可行，但經(jīng)過農(nóng)桿菌處理后，細(xì)胞都會(huì)受到程度不同的傷害，很可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，如果侵染后嚴(yán)重影響，可以改變侵染的菌液濃度 和時(shí)間。另外侵染過后將愈傷或外植體置于條件適宜的恢復(fù)培養(yǎng)基培養(yǎng)也很重要。另外，你再生體系的再生效率能達(dá)到多少？ 2，侵染后愈傷組織難以分化比較正常，加kan后變黃應(yīng)該是未轉(zhuǎn)入抗性基因的細(xì)胞，繼代后變疏松不知你繼代前后培養(yǎng)基有什么區(qū)別，還是建議侵染或共培后先在不加篩選劑的培養(yǎng)基上恢復(fù)一個(gè)周期。 3，這種情況也比較常見，正常來講個(gè)體差異存在，不過其他影響因素也比較多，不知你的外植體取得什么部位？很容易辨認(rèn)么？ 4，如果是kan篩選的話是會(huì)出現(xiàn)這種情況，kan本身就很不穩(wěn)定，尤其是加入培養(yǎng)基的時(shí)候不能太熱，另外不知道你做梯度試驗(yàn)的個(gè)體數(shù)有多少，太少的話也不容易對(duì)照出來，不確定苜蓿轉(zhuǎn)化的情況，對(duì)于其他植物來說200mg已經(jīng)比較大的濃度了，建議試下100mg。 植物轉(zhuǎn)基因本來就很難，周期長(zhǎng)，且每一步都可能影響到最后的轉(zhuǎn)化結(jié)果，再生體系正常的話（效率50%以上吧），主要精力需要放在侵染條件控制上，畢竟農(nóng)桿菌的侵染還是會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成損傷。簡(jiǎn)單講講，我也算是新手。 |
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2樓2012-01-06 09:38:53
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送鮮花一朵SongQ5285: 看來交流很重要。。。 2012-01-06 23:55:18
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首先真的非常感謝您的耐心詳細(xì)的回復(fù)，真后悔沒有早點(diǎn)發(fā)帖！嘿嘿 1、我是選了四個(gè)品種，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，5個(gè)不同的分化培養(yǎng)基篩選，因?yàn)槲廴镜仍�，最后只有一個(gè)品種的一種分化培養(yǎng)基分化出苗，陸陸續(xù)續(xù)的，再生效率在55%左右吧，后來轉(zhuǎn)化體系就按照再生體系的這個(gè)來做轉(zhuǎn)化了。 2、繼代前后的的培養(yǎng)基是相同的。目前做著幾批，就先不加卡納，暗培養(yǎng)一周。 3、外植體用的下胚軸，后來又嘗試子葉、葉柄。您說的容易辨認(rèn)是指什么�。� 4、卡納我篩選也是上面那這種情況，然后看文獻(xiàn)上很多都是用的50mg，就按50mg加了。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1皿，25個(gè)外植體。 謝謝你給的建議�。�！ |
3樓2012-01-06 20:47:12
lw19850128
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4樓2012-01-09 09:45:38
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5樓2012-06-25 20:35:12
confus
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6樓2013-10-02 22:53:01
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