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XLJ海闊天空金蟲 (小有名氣)
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[求助]
急救�。�！關于農桿菌轉化的一些問題
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蟲友們好! 我i是做的苜蓿的轉基因，遇見以下問題，請各位朋友幫助，馬上就該畢業(yè)了，轉基因還是沒長出來，急死了！實驗室之前沒人做過這方面的，急需您的指點�。�！ 1、再生體系已經建立，成功獲得再生植株。然后我就按照再生體系的培養(yǎng)基配方來做轉化。自己認為理論上用相同的培養(yǎng)基肯定應該可以轉化出苗的，但是一直沒有結果。我的這種假設是錯誤的嗎？ 2、在農桿菌侵染過后，外植體形成胚性愈傷較難，加卡納篩選后很多都褐化，或者發(fā)黃。有的前期看著狀態(tài)蠻好，但是繼代一次，愈傷就變的疏松，沒有內核，不知道是什么緣故？ 3、相同的品種、相同的部位的外植體，培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件什么的全都相同，但是在預培養(yǎng)3天后，有的下胚軸愈傷啟動，但是有的發(fā)褐，這種情況在我篩選合適的細胞分裂素濃度和生長素濃度時也屢次出現(xiàn)。不知道是什么原因，難道外植體本身個體差異那么大？ 4、在看不同抗生素濃度對愈傷形成及生長的影響時，抗生素600mg/l時居然比抗生素濃度200mg/l的愈傷長勢還好？每個處理3個重復的話，都會有一個愈傷一個也不長，發(fā)黃，沒反應了，郁悶，篩選不出來結果 請指教，萬分感謝�。�！ |
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lw19850128
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4樓2012-01-09 09:45:38
lw19850128
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
jhu132llh(金幣+4, APEPI+1): 鼓勵積極分享 2012-01-06 16:45:05
XLJ海闊天空(金幣+1): ★★★★★最佳答案 非常感謝您耐心詳細的解答，非常感謝您！ 2012-01-06 20:08:30
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先簡單回答下你的問題： 1，理論上可行，但經過農桿菌處理后，細胞都會受到程度不同的傷害，很可能影響細胞的生長和分化，如果侵染后嚴重影響，可以改變侵染的菌液濃度 和時間。另外侵染過后將愈傷或外植體置于條件適宜的恢復培養(yǎng)基培養(yǎng)也很重要。另外，你再生體系的再生效率能達到多少？ 2，侵染后愈傷組織難以分化比較正常，加kan后變黃應該是未轉入抗性基因的細胞，繼代后變疏松不知你繼代前后培養(yǎng)基有什么區(qū)別，還是建議侵染或共培后先在不加篩選劑的培養(yǎng)基上恢復一個周期。 3，這種情況也比較常見，正常來講個體差異存在，不過其他影響因素也比較多，不知你的外植體取得什么部位？很容易辨認么？ 4，如果是kan篩選的話是會出現(xiàn)這種情況，kan本身就很不穩(wěn)定，尤其是加入培養(yǎng)基的時候不能太熱，另外不知道你做梯度試驗的個體數(shù)有多少，太少的話也不容易對照出來，不確定苜蓿轉化的情況，對于其他植物來說200mg已經比較大的濃度了，建議試下100mg。 植物轉基因本來就很難，周期長，且每一步都可能影響到最后的轉化結果，再生體系正常的話（效率50%以上吧），主要精力需要放在侵染條件控制上，畢竟農桿菌的侵染還是會對植物細胞造成損傷。簡單講講，我也算是新手。 |
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2樓2012-01-06 09:38:53
XLJ海闊天空
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送鮮花一朵SongQ5285: 看來交流很重要。。。 2012-01-06 23:55:18
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首先真的非常感謝您的耐心詳細的回復，真后悔沒有早點發(fā)帖！嘿嘿 1、我是選了四個品種，愈傷誘導培養(yǎng)基相同，5個不同的分化培養(yǎng)基篩選，因為污染等原因，最后只有一個品種的一種分化培養(yǎng)基分化出苗，陸陸續(xù)續(xù)的，再生效率在55%左右吧，后來轉化體系就按照再生體系的這個來做轉化了。 2、繼代前后的的培養(yǎng)基是相同的。目前做著幾批，就先不加卡納，暗培養(yǎng)一周。 3、外植體用的下胚軸，后來又嘗試子葉、葉柄。您說的容易辨認是指什么��？ 4、卡納我篩選也是上面那這種情況，然后看文獻上很多都是用的50mg，就按50mg加了。每個處理3個重復，每個重復1皿，25個外植體。 謝謝你給的建議�。�！ |
3樓2012-01-06 20:47:12
cato8163
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5樓2012-06-25 20:35:12
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