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XLJ海闊天空

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[求助] 急救�。�！關(guān)于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的一些問(wèn)題

蟲(chóng)友們好! 我i是做的苜蓿的轉(zhuǎn)基因，遇見(jiàn)以下問(wèn)題，請(qǐng)各位朋友幫助，馬上就該畢業(yè)了，轉(zhuǎn)基因還是沒(méi)長(zhǎng)出來(lái)，急死了！實(shí)驗(yàn)室之前沒(méi)人做過(guò)這方面的，急需您的指點(diǎn)�。。�

1、再生體系已經(jīng)建立，成功獲得再生植株。然后我就按照再生體系的培養(yǎng)基配方來(lái)做轉(zhuǎn)化。自己認(rèn)為理論上用相同的培養(yǎng)基肯定應(yīng)該可以轉(zhuǎn)化出苗的，但是一直沒(méi)有結(jié)果。我的這種假設(shè)是錯(cuò)誤的嗎？
2、在農(nóng)桿菌侵染過(guò)后，外植體形成胚性愈傷較難，加卡納篩選后很多都褐化，或者發(fā)黃。有的前期看著狀態(tài)蠻好，但是繼代一次，愈傷就變的疏松，沒(méi)有內(nèi)核，不知道是什么緣故？
3、相同的品種、相同的部位的外植體，培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件什么的全都相同，但是在預(yù)培養(yǎng)3天后，有的下胚軸愈傷啟動(dòng)，但是有的發(fā)褐，這種情況在我篩選合適的細(xì)胞分裂素濃度和生長(zhǎng)素濃度時(shí)也屢次出現(xiàn)。不知道是什么原因，難道外植體本身個(gè)體差異那么大？
4、在看不同抗生素濃度對(duì)愈傷形成及生長(zhǎng)的影響時(shí)，抗生素600mg/l時(shí)居然比抗生素濃度200mg/l的愈傷長(zhǎng)勢(shì)還好？每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)的話(huà)，都會(huì)有一個(gè)愈傷一個(gè)也不長(zhǎng)，發(fā)黃，沒(méi)反應(yīng)了，郁悶，篩選不出來(lái)結(jié)果

請(qǐng)指教，萬(wàn)分感謝�。。�

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1樓 2012-01-05 17:56:19

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SongQ5285: 看來(lái)交流很重要。。。 2012-01-06 23:55:18

引用回帖:

樓: Originally posted by lw19850128 at 2012-01-06 09:38:53:
先簡(jiǎn)單回答下你的問(wèn)題：
1，理論上可行，但經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌處理后，細(xì)胞都會(huì)受到程度不同的傷害，很可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，如果侵染后嚴(yán)重影響，可以改變侵染的菌液濃度和時(shí)間。另外侵染過(guò)后將愈傷或外植體置于條 ...

首先真的非常感謝您的耐心詳細(xì)的回復(fù)，真后悔沒(méi)有早點(diǎn)發(fā)帖！嘿嘿
1、我是選了四個(gè)品種，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，5個(gè)不同的分化培養(yǎng)基篩選，因?yàn)槲廴镜仍�，最后只有一個(gè)品種的一種分化培養(yǎng)基分化出苗，陸陸續(xù)續(xù)的，再生效率在55%左右吧，后來(lái)轉(zhuǎn)化體系就按照再生體系的這個(gè)來(lái)做轉(zhuǎn)化了。
2、繼代前后的的培養(yǎng)基是相同的。目前做著幾批，就先不加卡納，暗培養(yǎng)一周。
3、外植體用的下胚軸，后來(lái)又嘗試子葉、葉柄。您說(shuō)的容易辨認(rèn)是指什么��？
4、卡納我篩選也是上面那這種情況，然后看文獻(xiàn)上很多都是用的50mg，就按50mg加了。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1皿，25個(gè)外植體。
謝謝你給的建議�。�！

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3樓2012-01-06 20:47:12

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【答案】應(yīng)助回帖

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
jhu132llh(金幣+4, APEPI+1): 鼓勵(lì)積極分享 2012-01-06 16:45:05
XLJ海闊天空(金幣+1): ★★★★★最佳答案非常感謝您耐心詳細(xì)的解答，非常感謝您！ 2012-01-06 20:08:30

先簡(jiǎn)單回答下你的問(wèn)題：
1，理論上可行，但經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌處理后，細(xì)胞都會(huì)受到程度不同的傷害，很可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，如果侵染后嚴(yán)重影響，可以改變侵染的菌液濃度和時(shí)間。另外侵染過(guò)后將愈傷或外植體置于條件適宜的恢復(fù)培養(yǎng)基培養(yǎng)也很重要。另外，你再生體系的再生效率能達(dá)到多少？
2，侵染后愈傷組織難以分化比較正常，加kan后變黃應(yīng)該是未轉(zhuǎn)入抗性基因的細(xì)胞，繼代后變疏松不知你繼代前后培養(yǎng)基有什么區(qū)別，還是建議侵染或共培后先在不加篩選劑的培養(yǎng)基上恢復(fù)一個(gè)周期。
3，這種情況也比較常見(jiàn)，正常來(lái)講個(gè)體差異存在，不過(guò)其他影響因素也比較多，不知你的外植體取得什么部位？很容易辨認(rèn)么？
4，如果是kan篩選的話(huà)是會(huì)出現(xiàn)這種情況，kan本身就很不穩(wěn)定，尤其是加入培養(yǎng)基的時(shí)候不能太熱，另外不知道你做梯度試驗(yàn)的個(gè)體數(shù)有多少，太少的話(huà)也不容易對(duì)照出來(lái)，不確定苜蓿轉(zhuǎn)化的情況，對(duì)于其他植物來(lái)說(shuō)200mg已經(jīng)比較大的濃度了，建議試下100mg。

植物轉(zhuǎn)基因本來(lái)就很難，周期長(zhǎng)，且每一步都可能影響到最后的轉(zhuǎn)化結(jié)果，再生體系正常的話(huà)（效率50%以上吧），主要精力需要放在侵染條件控制上，畢竟農(nóng)桿菌的侵染還是會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成損傷。簡(jiǎn)單講講，我也算是新手。

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2樓2012-01-06 09:38:53

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lw19850128

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SongQ5285(金幣+2): “入門(mén)而已”，我覺(jué)得你很認(rèn)真。。。 2012-01-09 11:43:17

引用回帖:

3樓: Originally posted by XLJ海闊天空 at 2012-01-06 20:47:12:
首先真的非常感謝您的耐心詳細(xì)的回復(fù)，真后悔沒(méi)有早點(diǎn)發(fā)帖！嘿嘿
1、我是選了四個(gè)品種，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，5個(gè)不同的分化培養(yǎng)基篩選，因?yàn)槲廴镜仍颍詈笾挥幸粋€(gè)品種的一種分化培養(yǎng)基分化出苗，陸陸續(xù)續(xù)的 ...

容易辨認(rèn)就是切取外植體的時(shí)候能清楚地確定組織部位，例如，如果胚發(fā)育尚未完全的時(shí)候無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分上下胚軸。

重復(fù)只做25個(gè)可能看不太出來(lái)，我一般以100為單位都覺(jué)得有點(diǎn)不好分辨

就是這些吧組培確實(shí)挺麻煩的，我也只是剛?cè)腴T(mén)而已~

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4樓2012-01-09 09:45:38

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cato8163

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苜蓿轉(zhuǎn)化不好做。
做轉(zhuǎn)化以前，再生達(dá)到很高的頻率，轉(zhuǎn)化才能得到獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系。
外植體的選擇非常重要，如果選擇下胚軸，不建議，因?yàn)榛蛐筒灰粯樱焕诤罄m(xù)的分析，難以排除，結(jié)果不可靠。
還是多看看，國(guó)外的資料，會(huì)有很大啟發(fā)。
小可也是新手，以上僅代表個(gè)人觀點(diǎn)。

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5樓2012-06-25 20:35:12

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