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[求助]
擬南芥突變體問題
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| 我有一個A基因的突變體 鑒定為純合突變體， 本來我設(shè)計了一對這個基因的引物做定量PCR用， 但我用這對引物去擴(kuò)增這個基因的純合突變體時（模板為cDNA，提RNA時加了DNAase I 處理），也擴(kuò)增出了一條目的帶，送去測序，結(jié)果是這段序列是A基因的一段序列。但我理解突變體是純合的T-DNA插入突變，應(yīng)該沒有這個基因的mRNA存在的呀，怎么一做反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增可以擴(kuò)增出這個基因，不理解？求高手指點(diǎn)？ |
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sxxuan
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xpb2005
2樓2012-01-11 15:46:23
3樓2012-01-12 19:27:01
sxxuan
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【答案】應(yīng)助回帖
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T-DNA插入位點(diǎn)如何？是在外顯子還是內(nèi)含子？如果是外顯子的話，是靠近啟動子的5‘端還是3’端？如果插入靠近3‘端，那么之前的轉(zhuǎn)錄可能是不受影響的，如果你設(shè)計的引物是根據(jù)不受影響的序列來設(shè)計的，那當(dāng)然可以擴(kuò)出來，但用全長引物，由于下游序列被突變了，所以不能擴(kuò)增全長。 如果是上述的情況，你訂購?fù)蛔凅w的時候應(yīng)該把所以對突變株都買回來，實在不行，也得換個定量PCR的引物，盡量以突變了的序列來設(shè)計。 不過我覺得這樣其實是選擇了對自己有利的數(shù)據(jù)，并不是這個突變體的所有真實情況的反映，也比較難解釋突變體的表型之類的。 |
4樓2012-01-13 09:31:34
秋lover
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5樓2013-01-24 20:24:40
6樓2013-01-26 20:21:10
秋lover
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7樓2013-01-29 19:57:45
【答案】應(yīng)助回帖
★
xpb2005: 金幣+1, ★★★很有幫助 2013-06-19 22:34:24
xpb2005: 金幣+1, ★★★很有幫助 2013-06-19 22:34:24
| 首先你應(yīng)該告訴大家，你是怎么樣知道這個突變體就是純合突變體的。如果你是通過PCR的方法的話，你必須知道T-DNA的插入位點(diǎn)，根據(jù)插入為點(diǎn)，設(shè)計相關(guān)的引物。如果T-DNA插入位點(diǎn)位于基因的3“端的時候，全長可能沒有了，但是插入位點(diǎn)的5‘端有可能還在表達(dá)。當(dāng)你的定量引物正好設(shè)計在插入位點(diǎn)5“端的時候，你當(dāng)然就可以擴(kuò)增出來了。這樣的情況，我也遇到過。 |
8樓2013-06-19 13:43:53
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