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bffgbgff新蟲(chóng) (小有名氣)
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溶解曲線的問(wèn)題
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我做的realtime-PCR，1-4號(hào)模板P其他的基因都很好，唯獨(dú)這個(gè)基因溶解曲線不好，相同的引物在不同的模板間溶解曲線不一樣。是為什么呢？見(jiàn)圖。 不知道哪位前輩遇到過(guò)這個(gè)問(wèn)題！ |
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海闊天空8158
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+6, MolEPI+1): 很熱心幫忙，授予EPI！ 2012-01-18 19:07:48
西瓜(金幣+6, MolEPI+1): 很熱心幫忙，授予EPI！ 2012-01-18 19:07:48
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按照現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)條件和你現(xiàn)在的描述，由于沒(méi)有足夠的模板，引物因此沒(méi)有經(jīng)過(guò)消耗。這樣的話，如果引物能夠形成二聚體的話，會(huì)很大比例的形成二聚體。 關(guān)于引物二聚體的形成難易程度，可以在PRIMER PREMIER 5.0中進(jìn)行驗(yàn)證。 或者，可以通過(guò)文獻(xiàn)查找的方法，合成比較成熟的引物。 如果時(shí)間允許的話，這些都可以試試。 祝實(shí)驗(yàn)順利。 |
8樓2012-01-16 16:40:52
海闊天空8158
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木(金幣+5): 歡迎應(yīng)助，常來(lái)啊 2012-01-14 21:34:11
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木(金幣+5): 歡迎應(yīng)助，常來(lái)啊 2012-01-14 21:34:11
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樓主能不能把橫坐標(biāo)一起粘過(guò)來(lái)��？這樣更有利于確定原因。 一般來(lái)說(shuō)出現(xiàn)小峰的原因包括: 1第四組對(duì)應(yīng)的樣品中核酸污染，造成非特應(yīng)性擴(kuò)增。 2引物二聚體峰：（可能是在加引物過(guò)程中摻雜了其他引物，或者引物濃度的原因） 另外，可以排除一下最后樣品中是不是有基因組DNA的污染。 祝實(shí)驗(yàn)順利。 |
2樓2012-01-14 17:38:21
blackrose8089
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3樓2012-01-14 17:53:11
bffgbgff
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4樓2012-01-15 14:39:55
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5樓2012-01-15 14:40:53
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
bffgbgff(金幣+2): ★有幫助 2012-01-16 15:50:59
小丹木木(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助，多多交流哦 2012-01-16 16:39:55
bffgbgff(金幣+2): ★有幫助 2012-01-16 15:50:59
小丹木木(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助，多多交流哦 2012-01-16 16:39:55
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通過(guò)樓主的回復(fù)，應(yīng)當(dāng)是目的基因轉(zhuǎn)錄后得到的RNA濃度太低。但是，與其他樣品（1和2）相比，使用的引物量雖然相同，但是相對(duì)的引物量太高。使本來(lái)不明顯的引物二聚體現(xiàn)象非常明顯。 建議樓主降低3號(hào)和4號(hào)中的引物使用量。這樣引物二聚體會(huì)降低。 另外，可以試一下在正式實(shí)驗(yàn)前，根據(jù)內(nèi)參，調(diào)整以下RNA的濃度（適當(dāng)稀釋）。 祝實(shí)驗(yàn)順利。 |
6樓2012-01-16 11:30:37
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7樓2012-01-16 15:50:19
西瓜
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9樓2012-01-18 19:07:16
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