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[求助] 溶解曲線的問題

我做的realtime-PCR，1-4號模板P其他的基因都很好，唯獨這個基因溶解曲線不好，相同的引物在不同的模板間溶解曲線不一樣。是為什么呢？見圖。
不知道哪位前輩遇到過這個問題！

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1樓 2012-01-13 15:50:32

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小丹木木(金幣+5): 歡迎應助，常來啊 2012-01-14 21:34:11

樓主能不能把橫坐標一起粘過來�。窟@樣更有利于確定原因。

一般來說出現小峰的原因包括:
1第四組對應的樣品中核酸污染，造成非特應性擴增。
2引物二聚體峰：（可能是在加引物過程中摻雜了其他引物，或者引物濃度的原因）

另外，可以排除一下最后樣品中是不是有基因組DNA的污染。

祝實驗順利。

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2樓2012-01-14 17:38:21

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西瓜(金幣+2, 專家考核): Good！ 2012-01-15 11:33:52

相同的引物在不同的模板間溶解曲線不一樣。如果是退火溫度不一樣的話，很有可能是有基因組DNA的污染或是非特異性的擴增，帶來的產物不均一。

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jiayoubashaonian

3樓2012-01-14 17:53:11

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樓: Originally posted by 海闊天空8158 at 2012-01-14 17:38:21:
樓主能不能把橫坐標一起粘過來��？這樣更有利于確定原因。

一般來說出現小峰的原因包括:
1第四組對應的樣品中核酸污染，造成非特應性擴增。
2引物二聚體峰：（可能是在加引物過程中摻雜了其他引物，或者引物 ...

重復過一次，結果還是這個樣子，排除加錯引物的可能，PCR完了后跑了個電泳，3,4號樣品目的基因很弱，引物二聚體很強。無雜帶出現！，十分不解原因。

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4樓2012-01-15 14:39:55

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樓: Originally posted by blackrose8089 at 2012-01-14 17:53:11:
相同的引物在不同的模板間溶解曲線不一樣。如果是退火溫度不一樣的話，很有可能是有基因組DNA的污染或是非特異性的擴增，帶來的產物不均一。

跑電泳，無雜帶出現啊。是不是目的基因表達很弱的原因

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5樓2012-01-15 14:40:53

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bffgbgff(金幣+2): ★有幫助 2012-01-16 15:50:59
小丹木木(金幣+2): 鼓勵應助，多多交流哦 2012-01-16 16:39:55

引用回帖:

4樓: Originally posted by bffgbgff at 2012-01-15 14:39:55:
重復過一次，結果還是這個樣子，排除加錯引物的可能，PCR完了后跑了個電泳，3,4號樣品目的基因很弱，引物二聚體很強。無雜帶出現！，十分不解原因。

通過樓主的回復，應當是目的基因轉錄后得到的RNA濃度太低。但是，與其他樣品（1和2）相比，使用的引物量雖然相同，但是相對的引物量太高。使本來不明顯的引物二聚體現象非常明顯。

建議樓主降低3號和4號中的引物使用量。這樣引物二聚體會降低。

另外，可以試一下在正式實驗前，根據內參，調整以下RNA的濃度（適當稀釋）。

祝實驗順利。

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6樓2012-01-16 11:30:37

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樓: Originally posted by 海闊天空8158 at 2012-01-16 11:30:37:
通過樓主的回復，應當是目的基因轉錄后得到的RNA濃度太低。但是，與其他樣品（1和2）相比，使用的引物量雖然相同，但是相對的引物量太高。使本來不明顯的引物二聚體現象非常明顯。

建議樓主降低3號和4號中的引 ...

多謝意見。我1ugRNA逆轉錄后，我用nanodrop2000測過單鏈cDNA濃度。和其他樣本基本無差別，PCR時，模板稀釋了10倍！1，2,3,4，GAPDH的CT值都是18左右。另外引物稀釋過一倍，還是這個樣子！打算重新收集一批RNA再重復。
如果樣本不表達這個基因的話，是不是引物就基本成了引物二聚體了？？

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7樓2012-01-16 15:50:19

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西瓜(金幣+6, MolEPI+1): 很熱心幫忙，授予EPI！ 2012-01-18 19:07:48

引用回帖:

7樓: Originally posted by bffgbgff at 2012-01-16 15:50:19:
多謝意見。我1ugRNA逆轉錄后，我用nanodrop2000測過單鏈cDNA濃度。和其他樣本基本無差別，PCR時，模板稀釋了10倍！1，2,3,4，GAPDH的CT值都是18左右。另外引物稀釋過一倍，還是這個樣子！打算重新收集一批RNA再重 ...

按照現在的實驗條件和你現在的描述，由于沒有足夠的模板，引物因此沒有經過消耗。這樣的話，如果引物能夠形成二聚體的話，會很大比例的形成二聚體。

關于引物二聚體的形成難易程度，可以在PRIMER PREMIER 5.0中進行驗證。

或者，可以通過文獻查找的方法，合成比較成熟的引物。

如果時間允許的話，這些都可以試試。

祝實驗順利。

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8樓2012-01-16 16:40:52

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引用回帖:

8樓: Originally posted by 海闊天空8158 at 2012-01-16 16:40:52:
按照現在的實驗條件和你現在的描述，由于沒有足夠的模板，引物因此沒有經過消耗。這樣的話，如果引物能夠形成二聚體的話，會很大比例的形成二聚體。

關于引物二聚體的形成難易程度，可以在PRIMER PREMIER 5.0 ...

有一定道理。樓主可以看看擴增曲線，看看PCR反應有沒有到達平臺期。如果模板濃度低的樣品沒有到達平臺期，說明PCR體系還沒消耗盡，那可能就是海闊天空8158 說的情況。

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9樓2012-01-18 19:07:16

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