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qingtingzhe銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
請(qǐng)教RNA提取高手：反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR)中DNA的去除
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我現(xiàn)在一直做qPCR.,但RNA的DNA一直除不凈，我采取了一下步驟，但DNA依然無法除盡： 1 加入氯仿后，離心后400多微升的上清我只取200微升 2 得到RNA后，我加入DNase1除DNA ，50微升加5微升，反應(yīng)時(shí)間為1hour 但最后進(jìn)行PCR檢驗(yàn)，用16S v3-V5區(qū)（我做的是細(xì)菌）的引物，進(jìn)行PCR, 31cycles，最后發(fā)現(xiàn)除DNA的RNA中仍然p出條帶 |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | RNA提取 |
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14樓2012-02-16 16:59:29
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15樓2012-02-16 17:01:09
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PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time) takara的，這個(gè)應(yīng)該很適合你的。 |
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6樓2012-02-15 15:33:45
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送鮮花一朵 |
說明書中50微升體系中加2微升酶，反應(yīng)時(shí)間為20-30分鐘，如果基因組DNA沒有出去，說明書中建議增加酶量或延長反應(yīng)時(shí)間，于是我將酶加大到5微升，時(shí)間延長到1個(gè)小時(shí)，但用PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)仍有微弱的條帶。說明書如下： 1. 在微量離心管中配制下列反應(yīng)液，全量50 μl。 全RNA 20～50 μg 10×DNase I Buffer 5 μl Recombinant DNase I（RNase-free，5 U/μl） 2 μl RNase Inhibitor（40 U/μl） 20 Units DEPC-treated water up to 50 μl 2. 37℃反應(yīng)20～30分鐘。 3. 使用以下兩種方法使Recombinant DNase I失活。 A．熱處理 （1） 加入2.5 μl 0.5 M EDTA，混勻，80℃加熱處理2 min。 （2） 用RNase Free dH2O定容至100 μl。 B．苯酚/氯仿抽提 （1） 用50 μl RNase Free dH2O定容至100 μl后加入等體 積的苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）混勻。 （2） 室溫，12,000 rpm離心5 min，取上清。 （3） 加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1）混勻。 （4） 室溫，12,000 rpm離心5 min，取上清。 4. 加入10 μl 3 M醋酸鈉和250 μl冷乙醇，-80℃放置20 min。 5. 4℃，12,000 rpm離心10 min，棄上清。 6. 加入70%冷乙醇洗凈，4℃，12,000 rpm離心5 min，棄上清。 7. 沉淀干燥。 8. 用適量的RNase Free dH2O溶解后， 進(jìn)行Agarose 電泳確認(rèn)是 否除去基因組 DNA，同時(shí)測(cè)定 RNA 的濃度。如果基因組 DNA 沒有被完全除去，可以適當(dāng)增加Recombinant DNase I(RNase -free)的添加量或者延長反應(yīng)時(shí)間。 想請(qǐng)教你幾個(gè)問題 （1）說明書中在用DNase1 處理完后，我是直接80度，10分鐘處理。而說明書在加了很多步驟（3-8步驟），不知3-8步驟的作用是什么？我的處理對(duì)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生什么影響？ （2)你在答復(fù)中提到消化1h之后再補(bǔ)加一點(diǎn)DNase ，為什么不在開始時(shí)就多加點(diǎn)酶呢？難道酶很容易失火？ |
3樓2012-02-15 11:51:10
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木(金幣+3): good 2012-02-16 13:41:11
qingtingzhe(金幣+10): ★有幫助 2012-02-16 16:40:18
qingtingzhe(金幣+10): ★有幫助 謝謝了 2012-02-20 11:18:23
小丹木木(金幣+3): good 2012-02-16 13:41:11
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qingtingzhe(金幣+10): ★有幫助 謝謝了 2012-02-20 11:18:23
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有沒有在提取完RNA后跑個(gè)膠試一試？個(gè)人認(rèn)為RNA提取的試劑有一定關(guān)系，我以前買生工的trizol，提出的rna里DNA較多，后來用invitrogen的trizol效果還不錯(cuò)，就是貴點(diǎn)，至少在電泳檢測(cè)的時(shí)候沒看到DNA的條帶，不知道你用的是哪個(gè)公司的試劑，或者是自己配的提取液。你說的取上清時(shí)候減量的確很必要。 DNaseI處理后也應(yīng)該跑一下。 至于你說的用16S去P還能有條帶，會(huì)不會(huì)是有污染呢？即便可能性比較小也可以考慮下。 DNaseI說明書里的3-8是兩個(gè)方法，看你說的意思是你用的熱處理法，這個(gè)方法不推薦，因?yàn)槔镞吋拥腅DTA可能會(huì)影響你后續(xù)步驟，至少我以前用這個(gè)方法處理后P不出條帶來，同樣條件的酚仿抽提則可以，但是這個(gè)方法會(huì)讓你的RNA損耗很多，可以先多提點(diǎn)RNA，預(yù)備出損失的量，不過反轉(zhuǎn)也用不了多少。 希望可以幫到你。 |
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7樓2012-02-15 19:01:32
flyer8666
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| DNase是需要DNase buffer的，且RNA的量不要加的太多，具體要看DNase的說明書，可適當(dāng)延長DNase消化的時(shí)間，可以消化1h之后再補(bǔ)加一點(diǎn)DNase |
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2樓2012-02-14 21:50:34
qingtingzhe
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木(金幣+3): 鼓勵(lì)新蟲回帖應(yīng)助 2012-02-16 13:40:39
qingtingzhe(金幣+5): ★有幫助 2012-02-16 16:38:28
小丹木木(金幣+3): 鼓勵(lì)新蟲回帖應(yīng)助 2012-02-16 13:40:39
qingtingzhe(金幣+5): ★有幫助 2012-02-16 16:38:28
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1、DNase1直接80度10分鐘處理是不能完全滅活的。 2、加入DNase1除DNA 時(shí)，加入的酶量是多少？其實(shí)，酶切的時(shí)間更為關(guān)鍵，一般1U的DNase1在1hour能除去的DNA有限。建議延長時(shí)間到5小時(shí)或更長。 |
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5樓2012-02-15 14:40:32
hongyz
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
qingtingzhe(金幣+10): ★有幫助 2012-02-16 16:59:41
qingtingzhe(金幣+10): ★有幫助 2012-02-16 16:59:41
| 處理2次就好了，我們一直這么做。 |
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8樓2012-02-16 09:33:59
9樓2012-02-16 12:46:54
10樓2012-02-16 12:48:04
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