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[求助]
細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒的設(shè)計(jì)
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小女子最近剛接觸質(zhì)粒。想請(qǐng)問(wèn)，以下問(wèn)題： 1，我想讓我的目的蛋白在細(xì)胞中表達(dá)的同時(shí)，同時(shí)表達(dá)GFP，在不表達(dá)目的蛋白時(shí)，不表達(dá)GFP，這樣的質(zhì)粒怎么設(shè)計(jì)？怎么選取質(zhì)粒？或者用別的載體？？ 2，目的蛋白在細(xì)胞中的總表達(dá)量不受改變。就是說(shuō)在以后的刺激試驗(yàn)中，該增加蛋白表達(dá)的時(shí)候增加，該減小的時(shí)候減小，不受轉(zhuǎn)染影響。 3，我希望能穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，建立永久的細(xì)胞系。 有沒(méi)有哪位大俠能幫我解答一下。沒(méi)坐過(guò)分子克隆方面的試驗(yàn)，一竅不通。謝謝指導(dǎo) |
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木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
小丹木木(金幣+5, MolEPI+1): 很熱心哦 2012-02-20 10:21:06
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第一個(gè)問(wèn)題：構(gòu)建共表達(dá)載體，將GFP基因與目標(biāo)蛋白基因連接到同一個(gè)載體中，置于同一個(gè)啟動(dòng)子下。從理論上將這樣可以保證兩個(gè)基因的協(xié)同表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)GFP的表達(dá)量來(lái)預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。但是從實(shí)際經(jīng)驗(yàn)上講，即使在同一個(gè)啟動(dòng)子，也不能保證GFP與目標(biāo)蛋白的表達(dá)量一致，通常而這的表達(dá)量會(huì)相差10倍甚至更多，這直接與基因的序列，表達(dá)效率有關(guān)。 第二個(gè)問(wèn)題：你說(shuō)的問(wèn)題的實(shí)質(zhì)是轉(zhuǎn)化體基因組中目的基因的拷貝數(shù)穩(wěn)定�？截悢�(shù)的多少及目的基因插入的位點(diǎn)決定了細(xì)胞中目的蛋白的表達(dá)量。只要目的基因插入的位點(diǎn)及拷貝數(shù)穩(wěn)定了，你所說(shuō)的問(wèn)題也就解決了。而拷貝數(shù)及插入位點(diǎn)的穩(wěn)定化，其實(shí)就是要建立穩(wěn)定細(xì)胞系，因?yàn)榉�(wěn)定細(xì)胞系之所以穩(wěn)定就是因?yàn)槠淠康幕虻目截悢?shù)及插入位點(diǎn)穩(wěn)定。 第三個(gè)問(wèn)題：建立穩(wěn)定細(xì)胞系，就是要挑單克隆細(xì)胞了。使用電轉(zhuǎn)化和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化可以提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的效率，這兩種方法的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率最高，可以達(dá)到60-80%。轉(zhuǎn)染之后的挑選單克隆可以使用有限稀釋法和流式細(xì)胞儀分選法以及clonePIX FL 來(lái)做。有限稀釋費(fèi)事費(fèi)力，基本是靠人力來(lái)做了，后兩種方法有快多了，但是儀器昂貴多了。 |
9樓2012-02-18 08:46:01
2樓2012-02-17 11:01:19
小周
鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
susanuse(金幣+5): ★★★很有幫助 2012-02-17 12:54:40
小丹木木(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-02-17 13:43:42
susanuse(金幣+5): ★★★很有幫助 2012-02-17 12:54:40
小丹木木(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-02-17 13:43:42
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樓上說(shuō)的融合蛋白是一種方法。另外可以將兩個(gè)基因（GFP和目的基因）在一個(gè)質(zhì)粒中構(gòu)建，分別用自己的啟動(dòng)子和終止子。 目的蛋白的表達(dá)量不受改變，要建立穩(wěn)定的細(xì)胞株，大概耗時(shí)3-6個(gè)月的時(shí)間。還有你用的什么細(xì)胞有關(guān)。 |
3樓2012-02-17 11:16:56
4樓2012-02-17 11:26:30
5樓2012-02-17 11:28:34
小周
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6樓2012-02-17 14:25:37
7樓2012-02-17 15:48:57
ixido
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amisking(金幣+5): 鼓勵(lì)積極應(yīng)助！ 2012-02-17 18:28:57
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1 除了樓上的方法外，樓主可以找一下pEGFP的載體，這個(gè)載體自身帶有EGFP序列，并且可以在EGFPN端或者C端插入目的蛋白 2 這個(gè)問(wèn)題不大明白，不知道樓主想要什么樣的結(jié)果 3 篩選穩(wěn)定細(xì)胞系，這個(gè)取決于你真核細(xì)胞表達(dá)載體上帶有什么樣的篩選基因。只要將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，然后按照篩選的條件和抗生素類(lèi)型進(jìn)行篩選就行了。但是周期很長(zhǎng)，而且不一定能篩選出來(lái)。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
susanuse8樓2012-02-17 16:10:58
10樓2012-02-18 14:13:08
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