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空谷幽風(fēng)

金蟲 (正式寫手)

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

引用回帖:

10樓: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-21 10:35:28:
哦，謝謝。感受態(tài)沒問題，回收產(chǎn)物也測(cè)過了，很純的，回收時(shí)也注意了讓酒精揮發(fā)的問題。不知道卡那濃度一般應(yīng)該是多少�。课业目枪ぷ鳚舛仁�600mg/L,這個(gè)濃度是不是高呢？轉(zhuǎn)化質(zhì)粒時(shí)長的滿滿一板，可是自連就一 ...

到網(wǎng)上去查一下那卡霉素的工作濃度，你竟然用這么高的，沒見過！

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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?

31樓2012-02-22 21:26:09

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dxzhaomiao

金蟲 (正式寫手)

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-02-23 13:54:36
cxnde007: 金幣+5, ★有幫助, 我連接上了，做了很多改變，但是本人覺得做主要的是載體大片段和目的片段的濃度應(yīng)該大一些，連接效率也蠻高的 2012-03-19 17:55:28

我做過pBI121，連接效率是蠻低的，建議你增大載體濃度和回收產(chǎn)物濃度試試看。我比較傾向于是你的酶切可能有問題，你可以試試雙切，或者把兩個(gè)酶切順序換一下。現(xiàn)在我做克隆都用重組臂重組，就是在你目標(biāo)片段兩端加上15~20bp的重組臂，然后和酶切過的載體重組。不管怎樣不要?dú)怵H，找到原因一步步來

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32樓2012-02-23 09:12:49

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joblee

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

引用回帖:

4樓: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-21 08:58:00:
感受態(tài)已經(jīng)換過了，應(yīng)該沒有問題。
自連也不長菌，我的目的片段是從pmd18-simple上雙酶切得到的，而且載體的雙酶切也很徹底，我用酶切回收后的載體片段做轉(zhuǎn)化沒有菌落，這是不是說明酶切沒有問題呢，我以前沒做 ...

感受態(tài)沒問題，自連不長菌，會(huì)不會(huì)是T4連接體系的問題？連接酶或者緩沖液有問題

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33樓2012-02-23 09:24:09

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cxnde007

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引用回帖:

樓: Originally posted by 空谷幽風(fēng) at 2012-02-22 21:26:09:
到網(wǎng)上去查一下那卡霉素的工作濃度，你竟然用這么高的，沒見過！

不好意思，我寫錯(cuò)了，不是600，是60mg/L

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堅(jiān)強(qiáng)不是我的錯(cuò)

34樓2012-02-23 11:59:34

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cxnde007

銅蟲 (小有名氣)

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引用回帖:

樓: Originally posted by dxzhaomiao at 2012-02-23 09:12:49:
我做過pBI121，連接效率是蠻低的，建議你增大載體濃度和回收產(chǎn)物濃度試試看。我比較傾向于是你的酶切可能有問題，你可以試試雙切，或者把兩個(gè)酶切順序換一下。現(xiàn)在我做克隆都用重組臂重組，就是在你目標(biāo)片段兩端加 ...

恩，謝謝

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堅(jiān)強(qiáng)不是我的錯(cuò)

35樓2012-02-23 12:01:08

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cxnde007

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樓: Originally posted by joblee at 2012-02-23 09:24:09:
感受態(tài)沒問題，自連不長菌，會(huì)不會(huì)是T4連接體系的問題？連接酶或者緩沖液有問題

連接體系是10ul,連接酶和緩沖液各1ul，載體和目的基因則是換過不同的比例，這個(gè)會(huì)有問題嗎？至于連接酶和緩沖液我也換過了

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堅(jiān)強(qiáng)不是我的錯(cuò)

36樓2012-02-23 12:03:26

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36樓: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-23 12:03:26:
連接體系是10ul,連接酶和緩沖液各1ul，載體和目的基因則是換過不同的比例，這個(gè)會(huì)有問題嗎？至于連接酶和緩沖液我也換過了

酶和緩沖液有點(diǎn)少吧？

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37樓2012-02-25 23:00:26

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haoying1986

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

我也做過重組的質(zhì)粒的構(gòu)建，同樣的問題我也遇見過。應(yīng)該是這樣的：
1.你做酶切的時(shí)候時(shí)間過長了，分布雙酶切時(shí)，每個(gè)酶的酶切時(shí)間最多也就兩個(gè)小時(shí)，酶的用量，你可以查閱酶的說明書。你的分布雙酶切沒必要那么做，我們實(shí)驗(yàn)室也做過你說的這兩個(gè)酶的分布雙酶切，就是從低鹽到高鹽的順序就可以了，你可以先用SacI酶切，然后再用BamHI酶切，酶切體系如下：
50μl的體系里加入SacI 1.2μl，DNA約1μg，其他的Buffer和水，你看著體系補(bǔ)就行了，酶切1.5h；然后再加大體系，擴(kuò)成150μl的體系，加入BamHI2μl，Buffer和水補(bǔ)足。各自酶在最適的Buffer里切割。補(bǔ)充一下，單酶切一個(gè)之后，為了排除對(duì)下一個(gè)酶的影響，你可以高溫使酶失活一下。不做這一步也行的。
2.載體和目的片段都要照著上述的步驟分布雙酶切，不知道你切下來的片段大小了，如果切下來的片段大小跟留下來的差不多，建議你割膠回收，如果差別很大，就可以用生工生物的PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化酶切后的產(chǎn)物。最后得到用于連接的目的片段和載體，用瓊脂糖凝膠鑒定一下，條帶的亮度，建議加個(gè)marker，可以估算一下DNA的分子質(zhì)量，以便于下一步的連接。
3.連接體系的確定就看連接酶說明書上的就行，目的片段和載體的比例如何確定的呢，看你的目的片段和載體的大小了，如果相差的多，目的片段：載體=3:1~10：1，如果差不多，就等比例加或者直接3:1做就行了。
4.最后涂板的時(shí)候，我的建議是你做上以下幾個(gè)對(duì)照，卡那霉素平板上加你的感受態(tài)細(xì)胞，這個(gè)是鑒定感受態(tài)細(xì)胞有沒有污染的；一個(gè)是載體自己連接
的，就是看看雙酶切有沒有切完全；一個(gè)是感受態(tài)細(xì)胞涂在LB平板上的，看
感受態(tài)細(xì)胞效率怎么樣；這些對(duì)照和你的轉(zhuǎn)化涂板同時(shí)做，就可以知道問題出在哪里了。
以上就是我的建議，希望對(duì)你有幫助。

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38樓2012-04-20 14:12:19

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cxnde007

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38樓: Originally posted by haoying1986 at 2012-04-20 14:12:19:
我也做過重組的質(zhì)粒的構(gòu)建，同樣的問題我也遇見過。應(yīng)該是這樣的：
1.你做酶切的時(shí)候時(shí)間過長了，分布雙酶切時(shí)，每個(gè)酶的酶切時(shí)間最多也就兩個(gè)小時(shí)，酶的用量，你可以查閱酶的說明書。你的分布雙酶切沒必要那么做 ...

我已經(jīng)連上了，不過還是謝謝您的建議

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堅(jiān)強(qiáng)不是我的錯(cuò)

39樓2012-04-22 11:57:13

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chenxiang29

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2樓: Originally posted by panda73 at 2012-02-20 22:55:32:
你克隆不成功的現(xiàn)象是什么？
如果是無克�。耗强赡苁悄愕母惺軕B(tài)不好用，可以訂購新的
如果是無陽性克�。何医ㄗh你做一個(gè)空載體的自連對(duì)照（即設(shè)計(jì)一個(gè)用水代替700bp片段的平行對(duì)照），如果自連對(duì)照也長很多克隆 ...

貌似這個(gè)網(wǎng)站進(jìn)不去哦

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smile to the world

40樓2012-04-22 14:33:24

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