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構建pBI121表達載體，目的基因與載體連接不上 已有1人參與
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連續(xù)做了兩個多月的表達載體構建了，始終不成功，希望各位大俠給與指點，具體情況如下： 載體為pBI121,目的基因700bp左右（兩端分別加有BamHI 和SacI酶切位點，連接在pmd18-simple上），用這兩個酶分別對pBI121和目的基因進行雙酶切（先是BamHI 30度 4h,沉淀回收后SacI 37度 4h），電泳檢測（酶切完全）并回收，回收后電泳檢測條帶清晰可見，且大小也是對的。將回收的載體片段與目的基因用連接酶連接（用過寶生物的T4連接酶，現(xiàn)改為NEB的），轉化、涂板，來來回回做了不知道多少遍了，現(xiàn)在是在是不知道該怎么辦了，哪位做過、遇到過這些問題的大俠幫幫吧，謝謝啦！ |
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【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數(shù) +1
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我也做過重組的質粒的構建，同樣的問題我也遇見過。應該是這樣的： 1.你做酶切的時候時間過長了，分布雙酶切時，每個酶的酶切時間最多也就兩個小時，酶的用量，你可以查閱酶的說明書。你的分布雙酶切沒必要那么做，我們實驗室也做過你說的這兩個酶的分布雙酶切，就是從低鹽到高鹽的順序就可以了，你可以先用SacI酶切，然后再用BamHI酶切，酶切體系如下： 50μl的體系里加入SacI 1.2μl，DNA約1μg，其他的Buffer和水，你看著體系補就行了，酶切1.5h；然后再加大體系，擴成150μl的體系，加入BamHI2μl，Buffer和水補足。各自酶在最適的Buffer里切割。補充一下，單酶切一個之后，為了排除對下一個酶的影響，你可以高溫使酶失活一下。不做這一步也行的。 2.載體和目的片段都要照著上述的步驟分布雙酶切，不知道你切下來的片段大小了，如果切下來的片段大小跟留下來的差不多，建議你割膠回收，如果差別很大，就可以用生工生物的PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化酶切后的產(chǎn)物。最后得到用于連接的目的片段和載體，用瓊脂糖凝膠鑒定一下，條帶的亮度，建議加個marker，可以估算一下DNA的分子質量，以便于下一步的連接。 3.連接體系的確定就看連接酶說明書上的就行，目的片段和載體的比例如何確定的呢，看你的目的片段和載體的大小了，如果相差的多，目的片段：載體=3:1~10：1，如果差不多，就等比例加或者直接3:1做就行了。 4.最后涂板的時候，我的建議是你做上以下幾個對照，卡那霉素平板上加你的感受態(tài)細胞，這個是鑒定感受態(tài)細胞有沒有污染的；一個是載體自己連接 的，就是看看雙酶切有沒有切完全；一個是感受態(tài)細胞涂在LB平板上的，看 感受態(tài)細胞效率怎么樣；這些對照和你的轉化涂板同時做，就可以知道問題出在哪里了。 以上就是我的建議，希望對你有幫助。 |
38樓2012-04-20 14:12:19
panda73
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西瓜(金幣+2): 很熱心 2012-02-22 18:41:36
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我用雙酶切軟件算了一下你的實驗所需的酶量，發(fā)現(xiàn)SacI的酶用量應該比BamHI高至少一倍以上。如果你用同樣的酶量進行酶切，效果恐怕不太好。 你能確保載體本身處理的很好嗎？克隆失敗最可能的原因就是載體雙酶切不徹底，導致連接反應時載體的自連（載體自連的效率比外源片度插于載體的效率高至少10倍以上） 其實，判斷載體處理是否好的一個最可靠的方法就是：設置一個載體的自連接反應，然后轉化，看看克隆形成率（與目的連接進行比較），載體處理的好時，目的連接的克隆數(shù)較自連的克隆數(shù)高3倍以上。 |
6樓2012-02-21 09:46:36
zhiqiang5070
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8樓2012-02-21 09:56:28
30樓2012-02-22 19:57:47
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小丹木木(金幣+1): 鼓勵應助 2012-02-21 08:31:02
小丹木木(金幣+1): 鼓勵應助 2012-02-21 08:31:02
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你克隆不成功的現(xiàn)象是什么？ 如果是無克�。耗强赡苁悄愕母惺軕B(tài)不好用，可以訂購新的 如果是無陽性克�。何医ㄗh你做一個空載體的自連對照（即設計一個用水代替700bp片段的平行對照），如果自連對照也長很多克隆，表明你的載體處理有問題。如果自連和目的對照都無克隆，可能是感受態(tài)有問題或PCR產(chǎn)物的酶切有問題。 關于分子克隆中的酶切設計，我覺得一個在線軟件很好用，能夠精確計算雙酶切時所需的酶的精確用量（再也不用猜測酶量用得夠不夠了）還能推薦雙酶切的最優(yōu)buffer，使用很方便，而且現(xiàn)在還可以免費使用，用戶名和密碼都是test，你可以試一試，相信節(jié)省你做克隆的時間 |
2樓2012-02-20 22:55:32
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西瓜(金幣+1): 鼓勵熱心蟲蟲 2012-02-22 18:41:00
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cxnde007: 金幣+1, ★有幫助 2012-04-26 09:27:14
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雙酶切的在線軟件，用戶名和密碼都是test http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php |
3樓2012-02-20 22:56:12
4樓2012-02-21 08:58:00
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5樓2012-02-21 09:40:59
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