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構(gòu)建pBI121表達(dá)載體，目的基因與載體連接不上 已有1人參與
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連續(xù)做了兩個(gè)多月的表達(dá)載體構(gòu)建了，始終不成功，希望各位大俠給與指點(diǎn)，具體情況如下： 載體為pBI121,目的基因700bp左右（兩端分別加有BamHI 和SacI酶切位點(diǎn)，連接在pmd18-simple上），用這兩個(gè)酶分別對(duì)pBI121和目的基因進(jìn)行雙酶切（先是BamHI 30度 4h,沉淀回收后SacI 37度 4h），電泳檢測(cè)（酶切完全）并回收，回收后電泳檢測(cè)條帶清晰可見，且大小也是對(duì)的。將回收的載體片段與目的基因用連接酶連接（用過寶生物的T4連接酶，現(xiàn)改為NEB的），轉(zhuǎn)化、涂板，來來回回做了不知道多少遍了，現(xiàn)在是在是不知道該怎么辦了，哪位做過、遇到過這些問題的大俠幫幫吧，謝謝啦！ |
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zhiqiang5070
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木(金幣+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-02-21 10:08:12
小丹木木(金幣+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-02-21 10:08:12
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1.感受態(tài)細(xì)胞是否好使。載體卡那抗性的需要復(fù)蘇一個(gè)小時(shí)，還有涂板是玻璃棒不要用力 2.回收產(chǎn)物是否純凈，測(cè)一下目的片段和載體的OD值，260，280，230。 回收時(shí)酒精是否揮發(fā)干凈了，不然會(huì)影響連接的 3.你的兩個(gè)酶間距應(yīng)該在20bp以上吧，直接雙酶切不就行了，雙酶切效率高些 4.目的：載體的比例 |
7樓2012-02-21 09:53:14
panda73
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木(金幣+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-02-21 08:31:02
小丹木木(金幣+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-02-21 08:31:02
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你克隆不成功的現(xiàn)象是什么？ 如果是無克隆：那可能是你的感受態(tài)不好用，可以訂購新的 如果是無陽性克�。何医ㄗh你做一個(gè)空載體的自連對(duì)照（即設(shè)計(jì)一個(gè)用水代替700bp片段的平行對(duì)照），如果自連對(duì)照也長很多克隆，表明你的載體處理有問題。如果自連和目的對(duì)照都無克隆，可能是感受態(tài)有問題或PCR產(chǎn)物的酶切有問題。 關(guān)于分子克隆中的酶切設(shè)計(jì)，我覺得一個(gè)在線軟件很好用，能夠精確計(jì)算雙酶切時(shí)所需的酶的精確用量（再也不用猜測(cè)酶量用得夠不夠了）還能推薦雙酶切的最優(yōu)buffer，使用很方便，而且現(xiàn)在還可以免費(fèi)使用，用戶名和密碼都是test，你可以試一試，相信節(jié)省你做克隆的時(shí)間 |
2樓2012-02-20 22:55:32
panda73
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西瓜(金幣+1): 鼓勵(lì)熱心蟲蟲 2012-02-22 18:41:00
cxnde007: 金幣+1, ★有幫助 2012-04-26 09:27:14
西瓜(金幣+1): 鼓勵(lì)熱心蟲蟲 2012-02-22 18:41:00
cxnde007: 金幣+1, ★有幫助 2012-04-26 09:27:14
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雙酶切的在線軟件，用戶名和密碼都是test http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php |
3樓2012-02-20 22:56:12
4樓2012-02-21 08:58:00
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