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joyjane88銅蟲 (初入文壇)
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[交流]
PCR擴增法制備低拷貝質(zhì)粒（替代常規(guī)質(zhì)粒提�。� 已有8人參與
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| 大家好，近期構(gòu)建一載體，但所用出發(fā)載體質(zhì)粒是低拷貝的（約20個copies），但不是很大（5-6K）。每次用小提試劑盒提取得到的樣品量很低（10-20ng/ul），很不利于后期的酶切連接及轉(zhuǎn)化。本人想通過pcr的方法擴增來制備這個質(zhì)粒（制備量應(yīng)該可以達到50ng/ul以上，而且可以擴增好多管），但沒有查到相關(guān)的方法（有用PCR擴增制備定點突變質(zhì)粒的，但沒有看到制備常規(guī)質(zhì)粒的PCR）。想問問大家可行嗎？歡迎大家給出寶貴意見。 |
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joyjane88
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amisking(金幣+5): 鼓勵積極應(yīng)助！ 2012-02-22 20:43:19
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問題是你的引物�。∥覀兺ǔ５囊锏哪┒硕际�-OH，在體外可不好直接形成磷酸二酯鍵呢！而做磷酸化我不知道會不會兩端都磷酸化了！ 而site-direction kit最后是通過細胞來擴增的；，單鏈進入細胞后再復(fù)制生成的。因此，你還是要好好考慮一下！ PS，20 copie還是很多的，增加一下細胞的量應(yīng)該是沒有問題的，做克隆神馬的還是很容易的，除非你要去轉(zhuǎn)染細胞什么的，那到是一個體力活兒，呵呵！ Good luck! |
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3樓2012-02-22 15:55:40
joyjane88
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5樓2012-02-22 16:26:35
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