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joyjane88銅蟲 (初入文壇)
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[交流]
PCR擴(kuò)增法制備低拷貝質(zhì)粒（替代常規(guī)質(zhì)粒提�。� 已有8人參與
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| 大家好，近期構(gòu)建一載體，但所用出發(fā)載體質(zhì)粒是低拷貝的（約20個(gè)copies），但不是很大（5-6K）。每次用小提試劑盒提取得到的樣品量很低（10-20ng/ul），很不利于后期的酶切連接及轉(zhuǎn)化。本人想通過pcr的方法擴(kuò)增來制備這個(gè)質(zhì)粒（制備量應(yīng)該可以達(dá)到50ng/ul以上，而且可以擴(kuò)增好多管），但沒有查到相關(guān)的方法（有用PCR擴(kuò)增制備定點(diǎn)突變質(zhì)粒的，但沒有看到制備常規(guī)質(zhì)粒的PCR）。想問問大家可行嗎？歡迎大家給出寶貴意見。 |
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2樓2012-02-22 14:51:48
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問題是你的引物啊！我們通常的引物的末端都是-OH，在體外可不好直接形成磷酸二酯鍵呢！而做磷酸化我不知道會(huì)不會(huì)兩端都磷酸化了！ 而site-direction kit最后是通過細(xì)胞來擴(kuò)增的；，單鏈進(jìn)入細(xì)胞后再復(fù)制生成的。因此，你還是要好好考慮一下！ PS，20 copie還是很多的，增加一下細(xì)胞的量應(yīng)該是沒有問題的，做克隆神馬的還是很容易的，除非你要去轉(zhuǎn)染細(xì)胞什么的，那到是一個(gè)體力活兒，呵呵！ Good luck! |
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joyjane88
3樓2012-02-22 15:55:40
joyjane88
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8樓2012-02-22 20:16:03
liuyu_sdili
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10樓2012-02-23 11:28:41
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