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求助2個關于組蛋白的問題，與檢測乙�；头核鼗嘘P
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沒有做過組蛋白這方面，實驗室其他師兄們也較少涉及，查文獻上面基本都是略過... 然后我現(xiàn)在涉及的一個實驗中要檢測H3的乙酰化，和H2B的泛素化水平。有幾個問題不解。 求檢測這兩者的protocol呀！！ koddisy@gmail.com 跪謝 然后我的問題如下： 1.第一個是組蛋白抽提的問題，用組蛋白試劑盒抽的組蛋白一般是抽得所有組蛋白，還是有不同的試劑盒，可以直接抽到H3？ 還是在設計的時候就已經(jīng)加入純化標簽，比如H2B-FLAG，然后純化H2B。。。我真不清楚~~ 2.乙�；趺礄z測，比如我要檢測H3的global的乙�；健Ｓ秩绻乙獧z測的只是H3K18的乙�；梢詫崿F(xiàn)嗎？乙�；彩琴I抗體檢測嗎？ 3.H2B的泛素化怎么檢測？我看文獻上是直接用泛素化抗體來檢測的，是的嘛？ 實在是不清楚，請不要笑話我呢，我也是為了能順利做實驗~~~ 跪求protocol~~~不甚感激�，F(xiàn)在滿腦子的疑惑啊�。�！ |
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抗體磷酸化 
銀蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 蛋白質(zhì)組學
【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數(shù) +1
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大量樣品測試，用快速檢測組蛋白乙酰化的ELISA方法比較簡單，這是南寧藍光生物技術公司采用的方法： 1） 將處理的細胞（潛在HDAC inhibitor處理？）懸浮液在1.5mL離心管于3000轉(zhuǎn)離心1分鐘， 去調(diào)上清。 細胞pelet留下萃取組蛋白 2）用50 uL的0.1 N的HCL萃取5uL左右的離心沉淀的處理細胞pelet中的組蛋白。 用移液槍頭反復上下吸放混細胞，以利細胞破裂和組蛋白釋放。然后沒隔5分鐘vortex一次。連續(xù)3-4次后與12000轉(zhuǎn)離心5分鐘。 取含有組蛋白的上清液。（組蛋白是堿性蛋白，在0.1N鹽酸下帶強正電荷而高度溶于水。 其他細胞蛋白基本因此變性而沉淀。這種萃取方法的總組蛋白純度可達50%以上）。 3 ）用移液槍在96孔板加80uL/well的0.2M的Na2CO3。 然后孔中加20uL在2）中萃取的組蛋白上清。要慢，防止CO2的突然冒出。于37度孵化30分鐘。 4）倒掉孔中溶液，加100uL/well的1%BSA in PBSt。 封閉30分鐘 5）用PBSt清洗well 4次， 加入0.25 ug/mL的抗乙酰賴氨酸抗體HRP標記（用1%BSA in PBSt稀釋）于室溫孵化30分鐘。 6）倒掉孔中溶液，用PBSt清洗 4次。 然后加100uL/well的HRP底物TMB顯色。組蛋白的乙酰化程度與顏色成正比。 抗乙�；嚢彼峥贵wHRP和TMB， 及各種乙�；鞍捉M學所需抗體及填料在國內(nèi)的南寧藍光生物技術（www.bl-biotech.com) 均有售。 |
2樓2012-03-26 10:55:21
chlorella409
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3樓2012-03-26 14:09:50
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