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Koddisy新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
求助2個(gè)關(guān)于組蛋白的問(wèn)題，與檢測(cè)乙�；头核鼗嘘P(guān)
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沒(méi)有做過(guò)組蛋白這方面，實(shí)驗(yàn)室其他師兄們也較少涉及，查文獻(xiàn)上面基本都是略過(guò)... 然后我現(xiàn)在涉及的一個(gè)實(shí)驗(yàn)中要檢測(cè)H3的乙�；�，和H2B的泛素化水平。有幾個(gè)問(wèn)題不解。 求檢測(cè)這兩者的protocol呀��！ koddisy@gmail.com 跪謝 然后我的問(wèn)題如下： 1.第一個(gè)是組蛋白抽提的問(wèn)題，用組蛋白試劑盒抽的組蛋白一般是抽得所有組蛋白，還是有不同的試劑盒，可以直接抽到H3？ 還是在設(shè)計(jì)的時(shí)候就已經(jīng)加入純化標(biāo)簽，比如H2B-FLAG，然后純化H2B。。。我真不清楚~~ 2.乙酰化怎么檢測(cè)，比如我要檢測(cè)H3的global的乙酰化水平。又如果我要檢測(cè)的只是H3K18的乙�；梢詫�(shí)現(xiàn)嗎？乙酰化也是買(mǎi)抗體檢測(cè)嗎？ 3.H2B的泛素化怎么檢測(cè)？我看文獻(xiàn)上是直接用泛素化抗體來(lái)檢測(cè)的，是的嘛？ 實(shí)在是不清楚，請(qǐng)不要笑話(huà)我呢，我也是為了能順利做實(shí)驗(yàn)~~~ 跪求protocol~~~不甚感激�，F(xiàn)在滿(mǎn)腦子的疑惑啊�。�！ |
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3樓2012-03-26 14:09:50
抗體磷酸化 
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【答案】應(yīng)助回帖
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大量樣品測(cè)試，用快速檢測(cè)組蛋白乙�；腅LISA方法比較簡(jiǎn)單，這是南寧藍(lán)光生物技術(shù)公司采用的方法： 1） 將處理的細(xì)胞（潛在HDAC inhibitor處理？）懸浮液在1.5mL離心管于3000轉(zhuǎn)離心1分鐘， 去調(diào)上清。 細(xì)胞pelet留下萃取組蛋白 2）用50 uL的0.1 N的HCL萃取5uL左右的離心沉淀的處理細(xì)胞pelet中的組蛋白。 用移液槍頭反復(fù)上下吸放混細(xì)胞，以利細(xì)胞破裂和組蛋白釋放。然后沒(méi)隔5分鐘vortex一次。連續(xù)3-4次后與12000轉(zhuǎn)離心5分鐘。 取含有組蛋白的上清液。（組蛋白是堿性蛋白，在0.1N鹽酸下帶強(qiáng)正電荷而高度溶于水。 其他細(xì)胞蛋白基本因此變性而沉淀。這種萃取方法的總組蛋白純度可達(dá)50%以上）。 3 ）用移液槍在96孔板加80uL/well的0.2M的Na2CO3。 然后孔中加20uL在2）中萃取的組蛋白上清。要慢，防止CO2的突然冒出。于37度孵化30分鐘。 4）倒掉孔中溶液，加100uL/well的1%BSA in PBSt。 封閉30分鐘 5）用PBSt清洗well 4次， 加入0.25 ug/mL的抗乙酰賴(lài)氨酸抗體HRP標(biāo)記（用1%BSA in PBSt稀釋?zhuān)┯谑覝胤趸?0分鐘。 6）倒掉孔中溶液，用PBSt清洗 4次。 然后加100uL/well的HRP底物TMB顯色。組蛋白的乙�；潭扰c顏色成正比。 抗乙�；�(lài)氨酸抗體HRP和TMB， 及各種乙�；鞍捉M學(xué)所需抗體及填料在國(guó)內(nèi)的南寧藍(lán)光生物技術(shù)（www.bl-biotech.com) 均有售。 |
2樓2012-03-26 10:55:21
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