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wcx蝸牛無蟲 (小有名氣)
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[求助]
質(zhì)粒構(gòu)建
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作為實驗新手，近期要構(gòu)建質(zhì)粒，有些問題要向各位高手請教。 1、pcr產(chǎn)物和載體的酶切體系怎么確定，有什么需要注意的。是不是環(huán)狀載體比線性片段難切。 2、目的片段和載體雙酶切后連接體系的確定，目的片段和載體的摩爾比多少為好。每次連接時是不是都要測兩者的濃度，根據(jù)公式再計算出兩者的用量。連接時有什么需要注意的。我用T4連接酶。 3、構(gòu)建質(zhì)粒有一系列的工作，各位在各個步驟中有什么特別需注意的。 |
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2樓2012-03-03 15:23:37
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3樓2012-03-03 17:31:42
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1.酶切體系，你可以參照限制性內(nèi)切酶的說明書，我一般都是載體30ul, 兩種酶各1ul, buffer 5ul, 加水至50ul.注意：不同的限制性內(nèi)切酶可能buffer也不一樣。我都是環(huán)狀質(zhì)粒切的，效果還不錯。我是設(shè)計帶有限制性內(nèi)切酶位點的引物去擴增目的基因，然后把這個基因連接到T載體上，然后再酶切的。 2 目的片段和載體的連接中比例大約為3/1左右。 3 構(gòu)建質(zhì)粒時最重要的是要保證你的感受態(tài)是OK的，兩種質(zhì)粒酶切3-6小時候，直接去跑膠，回收，立即連接。放置4度冰箱過夜，第二天下午轉(zhuǎn)化，涂板。 這個板的篩選壓力設(shè)置得小點，挑斑時多挑一些。 |
4樓2012-03-04 14:12:39
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5樓2012-03-07 09:57:33
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6樓2012-03-07 10:43:14
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7樓2012-03-07 13:33:53
【答案】應(yīng)助回帖
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gs目的基因與p PIC9K質(zhì)粒載體雙酶切 EcoRI和NotI雙酶切長度1400左右的目的基因體系： 10×H Buffer 2 μl 0.1% BSA 2 μl 0.1% TritonX-100 2 μl EcoRI和NotI DNA ≤1 μg 滅菌水 up to 20 μl 雙切pic9K質(zhì)粒 10×H Buffer 2 μl 0.1% BSA 2 μl 0.1% TritonX-100 2 μl EcoRI和NotI 質(zhì)粒 ≤1 μg 滅菌水 up to 20 μl 37℃ 1hr （寶生物） 酶切后取電泳檢測，并濃縮回收 2. T4連接酶連反應(yīng) 10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 μl DNA 片段 約 0.3 pmol 載體 DNA 約 0.03 pmol T4 DNA Ligase 1 μl dH2O up to 25 μl 16℃過夜反應(yīng) |
8樓2012-03-07 18:49:32
9樓2012-03-07 18:50:17
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