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wcx蝸牛無(wú)蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
質(zhì)粒構(gòu)建
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作為實(shí)驗(yàn)新手，近期要構(gòu)建質(zhì)粒，有些問(wèn)題要向各位高手請(qǐng)教。 1、pcr產(chǎn)物和載體的酶切體系怎么確定，有什么需要注意的。是不是環(huán)狀載體比線(xiàn)性片段難切。 2、目的片段和載體雙酶切后連接體系的確定，目的片段和載體的摩爾比多少為好。每次連接時(shí)是不是都要測(cè)兩者的濃度，根據(jù)公式再計(jì)算出兩者的用量。連接時(shí)有什么需要注意的。我用T4連接酶。 3、構(gòu)建質(zhì)粒有一系列的工作，各位在各個(gè)步驟中有什么特別需注意的。 |
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西子淚
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9樓2012-03-07 18:50:17
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3樓2012-03-03 17:31:42
xiazhiwuxie
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助，很熱心哦 2012-03-04 15:37:55
wcx蝸牛(金幣+3): ★★★很有幫助 2012-03-07 09:54:27
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wcx蝸牛(金幣+3): ★★★很有幫助 2012-03-07 09:54:27
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1.酶切體系，你可以參照限制性?xún)?nèi)切酶的說(shuō)明書(shū)，我一般都是載體30ul, 兩種酶各1ul, buffer 5ul, 加水至50ul.注意：不同的限制性?xún)?nèi)切酶可能buffer也不一樣。我都是環(huán)狀質(zhì)粒切的，效果還不錯(cuò)。我是設(shè)計(jì)帶有限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的引物去擴(kuò)增目的基因，然后把這個(gè)基因連接到T載體上，然后再酶切的。 2 目的片段和載體的連接中比例大約為3/1左右。 3 構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)最重要的是要保證你的感受態(tài)是OK的，兩種質(zhì)粒酶切3-6小時(shí)候，直接去跑膠，回收，立即連接。放置4度冰箱過(guò)夜，第二天下午轉(zhuǎn)化，涂板。 這個(gè)板的篩選壓力設(shè)置得小點(diǎn)，挑斑時(shí)多挑一些。 |
4樓2012-03-04 14:12:39
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