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丫頭good銀蟲 (初入文壇)
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土壤真菌PCR-DGGE中真菌ITS區(qū)引物的選擇
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本人初涉分子，要做有關(guān)土壤中真菌總菌的PCR-DGGE方面的實驗，查閱了一些文獻，現(xiàn)有幾個問題向大俠們請教。 1.查閱了一些文獻，看到所用真菌ITS區(qū)的引物有多種：ITS1/ITS2;ITS1/ITS4;ITS4/ITS5;ITS1-F/ITS2;ITS1-F/ITS4等。弱弱的問一句，我該怎么選擇引物，這些引物在應用中有什么區(qū)別？ 2.GC結(jié)構(gòu)應放在上游還是下游，看文獻中放在上游的也有，放在下游的也有，我該怎么選擇？ 謝謝大家！ |
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 土壤真菌 | 土壤真菌 | 分子生物學 | 高通量測序 |
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老夏853
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丫頭good: 金幣+2, ★★★很有幫助 2012-03-29 10:23:41
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額呵呵 剛才發(fā)現(xiàn)你曾經(jīng)給過我紅花 然后才看到你 這個帖子 這個問題我來回答你吧，， 首先你要知道真菌引物ITS1，ITS4 擴增的是真菌核糖體間隔區(qū)its1區(qū)，5.8S，以及ITS2 區(qū) 長度大概在六七百bp吧， 而DGGE 適合分析的片段長度大概在500以內(nèi)最好 所以不適于選取這一對引物來做DGGE, 第二，我們實驗室做真菌多樣性用的是18S V1 V2 區(qū)，有一對引物叫做GCfung 和NS1 的好像 你可以查查這對引物，有一篇日本人做的文章 較早了 比較了its 引物和18S 引物做土壤真菌多樣性的DGGE 結(jié)果，最后得出結(jié)論18S 的多樣性較高。當然 我也懷疑他用18S可能擴增到土壤里面動植物以及的DNA 當然多樣性就高了。 其實我想是不是可以選取ITS1區(qū) 和ITS 2 區(qū)分別去做DGGE 這樣片段變短了 而且特異性也較高，當然這是我的想法 ，我實驗不做真菌這塊。 另外 至于GC clam 加在上游還是下游，一般是在上游的5‘端。 DGGE 的方法目前算是比較落后的了 因為它能檢測到的多樣性并不是那么準確。如果條件允許 可以去做一點高通量測序來檢測樣品里面的真菌多樣性。 最后了 可能對你遇到的其他問題一點補充。土壤DNA 雜質(zhì)比較多。擴增的時候可能會很難，需要注意：DNA 不能反復凍融，最好能分小管保存，第二 擴增的時候可以加一點BSA 或者DMSO 或者吐溫。 呵呵 我知道就這么些了 |
2樓2012-03-22 18:56:55
木子勇夏
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【答案】應助回帖
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哦 對 這篇是比較18S 的引物 Comparison of 18S rDNA primers for estimating fungal diversity in agricultural soils using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis ITS1-F/ITS2;ITS1-F/ITS4 這兩對引物里面的ITS1-F 是針對真菌子囊菌類群設(shè)計的優(yōu)化引物 也有一篇文獻的 Design of a primer for ribosomal DNA internal transcribed spacer with enhanced specificity for ascomycetes |
3樓2012-03-22 19:01:34
丫頭good
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8樓2013-01-05 17:13:28
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