 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 9 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1907 | 回復: 8 | |||||
[交流]
N-末端 氨基酸測序——轉膜問題
|
|||||
|
各位蟲友： 小蟲用SDS-PAGE識別到一個分子量110kDa左右（0.75mm）膠，只是想知道N-末端20個氨基酸順序，不需要保持其活性，之后送到測序公司進行氨基酸識別。已經(jīng)在網(wǎng)上和自己實踐后進行了轉膜實驗，效果不是很理想。想和蟲友共同探討和完善轉膜方案，以便后續(xù)試驗順利進行： 我用PVDF膜進行轉膜，然后準備進行N-端氨基酸測序. 1. SDS-PAGE是還原電泳，用考馬斯藍染色條帶清晰。 1. PVDF膜放在甲醇里漂洗，去除膜中氣泡，便于蛋白轉移。 3. 轉膜緩沖液用CAPS pH11。 2. 制作三明治。用60V或100v電壓轉了一個小時，染色用立春紅S幾分鐘。 可能細節(jié)還有問題，期望蟲友和有經(jīng)驗的老師提供建議，提供詳細方案和建議。之后再進行整理，以便實驗順利進行！ |
回復此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 經(jīng)典資源帖 | 蛋白質(zhì)生物學實驗經(jīng)驗 |
» 猜你喜歡
293求調(diào)劑
已經(jīng)有14人回復
-
0703化學336分求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復
-
304求調(diào)劑
已經(jīng)有9人回復
-
281求調(diào)劑（0805）
已經(jīng)有8人回復
-
環(huán)境領域全國重點實驗室招收博士1-2名
已經(jīng)有3人回復
-
材料專碩306英一數(shù)二
已經(jīng)有10人回復
-
301求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復
-
一志愿天津大學化學工藝專業(yè)（081702）315分求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復
-
302求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復
-
26博士申請
已經(jīng)有3人回復
» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 關于測游離氨基酸的兩張方法 詢問大家！
已經(jīng)有6人回復
- 高等學校青年骨干教師國內(nèi)訪問學者——請大家?guī)臀覅⒖家幌逻@個情況，謝謝
已經(jīng)有31人回復
- 考研復習資料——馬哲圖表（細致、全面）
已經(jīng)有19人回復
- 鑄膜液脫泡問題
已經(jīng)有20人回復
- 關于DNA測序末端終止法的一點問題？
已經(jīng)有9人回復
- 【求助/交流】測序出來的序列如何轉換成氨基酸序列進行比對？
已經(jīng)有9人回復
» 搶金幣啦！回帖就可以得到:
-
物理學 調(diào)劑
+1/85
-
重慶醫(yī)科大學神經(jīng)科學中心/病生與生理系誠邀海內(nèi)外優(yōu)秀博士加盟博士后隊伍（長期）
+1/81
-
何時使用 CODA™ 科里奧利質(zhì)量流量儀表- 艾里卡特（Alicat）
+2/52
-
山東師范大學有機化學專業(yè)胡忠燕老師課題組招收2026屆碩士研究生以及調(diào)劑生
+1/40
-
中國科學院杭州醫(yī)學研究所覃江江課題組招聘博士后
+1/35
-
南開大學羅景山教授課題組招聘博士后（光/電催化、鈣鈦礦光伏方向）
+2/34
-
上海交通大學電催化方向博后招聘-有鋰電、高分子、燃料電池背景者優(yōu)先
+1/32
-
2026年工科碩士調(diào)劑-上海大學全國重點實驗室團隊-材料數(shù)據(jù)挖掘方向-研究生3-5人
+1/30
-
招碩士調(diào)劑生
+2/26
-
福建師范大學化學與材料學院杜克釗團隊博士/碩士招生
+1/14
-
【博士招生】武漢科技大學招收材料、化工、環(huán)境、冶金類2026年“申請-考核”制博士生
+1/8
-
“機械、材料”招生
+1/6
-
發(fā)paper
+1/5
-
上海師范大學化學與材料科學學院任新意副研究員招收調(diào)劑學生3-4名（有機化學專業(yè)）
+1/5
-
重慶大學誠招2026年生物材料方向博士生
+1/4
-
分離分析杰青課題組誠招科研人員
+1/3
-
125603工業(yè)工程與管理調(diào)劑
+1/2
-
2026年浙江清華長三角研究院智慧能源中心招聘博士后-電氣方向
+1/2
-
招收理論凝聚態(tài)物理/納米光學/量子計算方向博士、碩士研究生/博士后
+1/1
-
西安交通大學生命學院智能化診療裝備研究中心2026年博士生招生
+1/1
2樓2012-03-12 20:10:03
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5): 給個紅包，謝謝回帖
lizhijiang(金幣+10): 很全面，十分感謝！ 2012-03-13 08:25:47
wizardfan: 金幣+10, 謝謝分享經(jīng)驗 2012-08-31 04:55:06
小木蟲(金幣+0.5): 給個紅包，謝謝回帖
lizhijiang(金幣+10): 很全面，十分感謝！ 2012-03-13 08:25:47
wizardfan: 金幣+10, 謝謝分享經(jīng)驗 2012-08-31 04:55:06
|
（1)配制CAPS[3－（環(huán)己氨基）－1－丙磺酸，3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid]電印跡緩沖液：10×CAPS（100mmol/L）：取 CAPS 22.13g，加去離子水至900mL，用2mol/L NaOH （約20mL）將pH值調(diào)至11.0，然后定容至1L，貯存于4oC。 （2)CAPS電印跡緩沖液（含10％甲醇的1×CAPS）：取10×CAPS 200 mL,加甲醇200 mL，去離子水1600 mL。 （3)取出PVDF膜（Positively charged nylon，Polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜），用甲醇浸泡數(shù)秒鐘，然后放入CAPS電印跡緩沖液中。（注：以后的操作須防止PVDF膜干涸。如果膜變干，須重復本步驟的操作；CAPS電印跡緩沖液中的甲醇濃度范圍是0-20％，一般甲醇濃度高的緩沖液對低分子量蛋白的轉移效果好，而甲醇濃度低甚至不含甲醇的緩沖液則有利于高分子量蛋白的轉移。） （4)取出電泳凝膠，在CAPS緩沖液中浸泡5-10分鐘。 （5)將用于電印跡實驗的濾紙和海綿放入電印跡緩沖液中浸泡一下，然后按海綿、濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙、海綿的次序?qū)㈦娪≯E夾層裝好，并放入小型電轉槽中，用50V恒壓條件下跑空膠2-2.5小時預電泳后再上蛋白樣品進行電泳分離。在50V恒壓條件下（100-170mA）于室溫下進行電印跡轉移，轉移時間為0.5-2小時。（注：務必小心排盡凝膠和PVDF膜之間的氣泡。上述轉移條件適用于Bio-Rad小型電轉槽和分子量不太大的蛋白。在不同的實驗中，應根據(jù)具體的電轉移裝置和具體蛋白適當調(diào)整電轉移條件。例如對70kD以上的蛋白質(zhì)須延長轉移時間。） （6) 取出PVDF膜并用去離子水略為漂洗，用甲醇浸泡數(shù)秒鐘，然后進行染色。 （7) 考馬斯亮藍染色，可將0.1％考馬斯亮藍R-250溶于40％甲醇/1％乙酸，染色30-50秒（切勿超過1分鐘），用50％甲醇脫色（注意勤換脫色液），并用去離子水充分洗滌，然后即可剪下待測序的條帶，送上�；瞪锛夹g公司進行蛋白質(zhì)端測序(蛋白質(zhì)序列測序系統(tǒng):ABI PROCISETM492cLC)。 |
3樓2012-03-12 21:25:23
5樓2012-03-12 21:26:53
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
|
本帖內(nèi)容被屏蔽 |
6樓2012-07-21 19:00:48
冼亮淀粉酶
專家顧問 (知名作家)
-
專家經(jīng)驗: +248 - BioEPI: 73
- 應助: 257 (大學生)
- 貴賓: 0.272
- 金幣: 19454.4
- 帖子: 6586
- 在線: 2777.2小時
- 蟲號: 856414
7樓2012-07-22 14:38:21
8樓2012-07-23 09:01:59
9樓2012-08-29 16:10:55
簡單回復
QIN07184樓
2012-03-12 21:26
回復
相關版塊跳轉
我要訂閱樓主 lizhijiang 的主題更新
| 9 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 296求調(diào)劑 +5 | 大口吃飯 身體健 2026-03-13 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 0703化學調(diào)劑 ，六級已過，有科研經(jīng)歷 +8 | 曦熙兮 2026-03-15 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +4 | △小透明* 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 344求調(diào)劑 +4 | knight344 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料專碩274一志愿陜西師范大學求調(diào)劑 +5 | 薛云鵬 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 267一志愿南京工業(yè)大學0817化工求調(diào)劑 +6 | SUICHILD 2026-03-12 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +3 | 聽風就是雨； 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿985，本科211，0817化學工程與技術319求調(diào)劑 +5 | Liwangman 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +3 | 曼殊2266 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +10 | 小樓。 2026-03-12 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 0703化學調(diào)劑 290分有科研經(jīng)歷，論文在投 +7 | 膩膩gk 2026-03-14 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 22408總分284求調(diào)劑 +3 | InAspic 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 331求調(diào)劑（0703有機化學 +5 | ZY-05 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 308 085701 四六級已過求調(diào)劑 +7 | 溫喬喬喬喬 2026-03-12 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 招收0805（材料）調(diào)劑 +3 | 18595523086 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +7 | 7712b 2026-03-13 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料工程調(diào)劑 +4 | 咪咪空空 2026-03-11 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 274求調(diào)劑 +3 | S.H1 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿山大07化學 332分 四六級已過 本科山東雙非 求調(diào)劑！ +3 | 不想理你 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +3 | 152697 2026-03-12 | 4/200 |
|