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[交流]
N-末端 氨基酸測序——轉(zhuǎn)膜問題
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各位蟲友： 小蟲用SDS-PAGE識別到一個分子量110kDa左右（0.75mm）膠，只是想知道N-末端20個氨基酸順序，不需要保持其活性，之后送到測序公司進行氨基酸識別。已經(jīng)在網(wǎng)上和自己實踐后進行了轉(zhuǎn)膜實驗，效果不是很理想。想和蟲友共同探討和完善轉(zhuǎn)膜方案，以便后續(xù)試驗順利進行： 我用PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，然后準(zhǔn)備進行N-端氨基酸測序. 1. SDS-PAGE是還原電泳，用考馬斯藍染色條帶清晰。 1. PVDF膜放在甲醇里漂洗，去除膜中氣泡，便于蛋白轉(zhuǎn)移。 3. 轉(zhuǎn)膜緩沖液用CAPS pH11。 2. 制作三明治。用60V或100v電壓轉(zhuǎn)了一個小時，染色用立春紅S幾分鐘。 可能細節(jié)還有問題，期望蟲友和有經(jīng)驗的老師提供建議，提供詳細方案和建議。之后再進行整理，以便實驗順利進行！ |
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9樓2012-08-29 16:10:55
2樓2012-03-12 20:10:03
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小木蟲(金幣+0.5): 給個紅包，謝謝回帖
lizhijiang(金幣+10): 很全面，十分感謝！ 2012-03-13 08:25:47
wizardfan: 金幣+10, 謝謝分享經(jīng)驗 2012-08-31 04:55:06
小木蟲(金幣+0.5): 給個紅包，謝謝回帖
lizhijiang(金幣+10): 很全面，十分感謝！ 2012-03-13 08:25:47
wizardfan: 金幣+10, 謝謝分享經(jīng)驗 2012-08-31 04:55:06
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（1)配制CAPS[3－（環(huán)己氨基）－1－丙磺酸，3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid]電印跡緩沖液：10×CAPS（100mmol/L）：取 CAPS 22.13g，加去離子水至900mL，用2mol/L NaOH （約20mL）將pH值調(diào)至11.0，然后定容至1L，貯存于4oC。 （2)CAPS電印跡緩沖液（含10％甲醇的1×CAPS）：取10×CAPS 200 mL,加甲醇200 mL，去離子水1600 mL。 （3)取出PVDF膜（Positively charged nylon，Polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜），用甲醇浸泡數(shù)秒鐘，然后放入CAPS電印跡緩沖液中。（注：以后的操作須防止PVDF膜干涸。如果膜變干，須重復(fù)本步驟的操作；CAPS電印跡緩沖液中的甲醇濃度范圍是0-20％，一般甲醇濃度高的緩沖液對低分子量蛋白的轉(zhuǎn)移效果好，而甲醇濃度低甚至不含甲醇的緩沖液則有利于高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。） （4)取出電泳凝膠，在CAPS緩沖液中浸泡5-10分鐘。 （5)將用于電印跡實驗的濾紙和海綿放入電印跡緩沖液中浸泡一下，然后按海綿、濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙、海綿的次序?qū)㈦娪≯E夾層裝好，并放入小型電轉(zhuǎn)槽中，用50V恒壓條件下跑空膠2-2.5小時預(yù)電泳后再上蛋白樣品進行電泳分離。在50V恒壓條件下（100-170mA）于室溫下進行電印跡轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移時間為0.5-2小時。（注：務(wù)必小心排盡凝膠和PVDF膜之間的氣泡。上述轉(zhuǎn)移條件適用于Bio-Rad小型電轉(zhuǎn)槽和分子量不太大的蛋白。在不同的實驗中，應(yīng)根據(jù)具體的電轉(zhuǎn)移裝置和具體蛋白適當(dāng)調(diào)整電轉(zhuǎn)移條件。例如對70kD以上的蛋白質(zhì)須延長轉(zhuǎn)移時間。） （6) 取出PVDF膜并用去離子水略為漂洗，用甲醇浸泡數(shù)秒鐘，然后進行染色。 （7) 考馬斯亮藍染色，可將0.1％考馬斯亮藍R-250溶于40％甲醇/1％乙酸，染色30-50秒（切勿超過1分鐘），用50％甲醇脫色（注意勤換脫色液），并用去離子水充分洗滌，然后即可剪下待測序的條帶，送上�；瞪锛夹g(shù)公司進行蛋白質(zhì)端測序(蛋白質(zhì)序列測序系統(tǒng):ABI PROCISETM492cLC)。 |
3樓2012-03-12 21:25:23
5樓2012-03-12 21:26:53
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