liwanghua251

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[交流] 熒光PCR中，熒光閥值的問題

我做相對定量，什么時(shí)候需要手動設(shè)置閥值？
做了兩板PCR，怎么才能一起分析相對定量。例如，一個(gè)板子上是0h,12h,24h,36h。另一板上是0h,48h,60h,72h.想把他們同一起來比較，得出不同時(shí)間段的表達(dá)差異。
是否需要把兩板中的0h,的Ct值調(diào)成一致。

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1樓 2012-03-14 09:17:49

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shaquila

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liwanghua251: 回帖置頂 2012-03-17 15:38:08
liwanghua251: 金幣+5 2012-03-17 15:38:24

只要在指數(shù)期就可以，手動自動都行。要矯正不同板的數(shù)據(jù)有兩種方法。一種就是設(shè)定一個(gè)共有樣品為calibrator。另一種就是將數(shù)據(jù)結(jié)果即ct扣除整板數(shù)據(jù)的平均ct，但是這要求你設(shè)置板的時(shí)候是隨機(jī)分配樣品的。

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11樓2012-03-17 00:13:21

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西瓜

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liwanghua251(金幣+1): 2012-03-15 09:05:59
1949stone: 金幣+1, 鼓勵(lì) 2012-03-15 09:58:29

不用調(diào)閾值的，調(diào)了也沒意義。閾值雖然能影響CT值，但是不能影響Ct值的差異（前提是閾值設(shè)置在合理范圍）。
你兩個(gè)板的不同時(shí)間點(diǎn)的樣品分別和同一個(gè)板上的0h比較，兩個(gè)板的結(jié)果可以放在一起，不過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖龇☉?yīng)該是所有樣品都在同一個(gè)板上跑。

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2樓2012-03-14 22:43:50

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樓: Originally posted by 西瓜 at 2012-03-14 22:43:50:
不用調(diào)閾值的，調(diào)了也沒意義。閾值雖然能影響CT值，但是不能影響Ct值的差異（前提是閾值設(shè)置在合理范圍）。
你兩個(gè)板的不同時(shí)間點(diǎn)的樣品分別和同一個(gè)板上的0h比較，兩個(gè)板的結(jié)果可以放在一起，不過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖龇☉?yīng)該 ...

我也知道嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖龇�，但是�?shí)在是沒法放在一起。是不是說一般的閥值都不用改，按照機(jī)器給的就可以了嗎？
還有個(gè)問題就是，陰性對照的作用是什么？我做的陰性對照也有峰怎么回事？

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3樓2012-03-15 09:05:48

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liwanghua251: 金幣+1 2012-03-16 12:21:05

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3樓: Originally posted by liwanghua251 at 2012-03-15 09:05:48:
我也知道嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖龇�，但是�?shí)在是沒法放在一起。是不是說一般的閥值都不用改，按照機(jī)器給的就可以了嗎？
還有個(gè)問題就是，陰性對照的作用是什么？我做的陰性對照也有峰怎么回事？

一般做熒光定量的話都不用調(diào)閥值的，按機(jī)器默認(rèn)的就行。陰性對照有峰說明你的體系可能有污染

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4樓2012-03-15 17:49:10

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4樓: Originally posted by 小貓三兩只 at 2012-03-15 17:49:10:
一般做熒光定量的話都不用調(diào)閥值的，按機(jī)器默認(rèn)的就行。陰性對照有峰說明你的體系可能有污染

可能不可能是引物二聚體。

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5樓2012-03-16 12:20:24

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那為啥還要設(shè)手動閥值呢？

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6樓2012-03-16 12:21:01

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andyzhengwp

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liwanghua251: 金幣+1 2012-03-16 18:14:10

閾值是不用調(diào)的，機(jī)器自動生成，一般只有一個(gè)峰，如果出現(xiàn)兩個(gè)峰有可能是引物二聚體，或者是加樣出現(xiàn)了問題

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7樓2012-03-16 12:43:38

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5樓: Originally posted by liwanghua251 at 2012-03-16 12:20:24:
可能不可能是引物二聚體。

陰性對照沒有模板，只有引物，怎么會有帶？所以不會是引物二聚體，應(yīng)該是你的體系污染。如果你的樣品擴(kuò)增過程中出現(xiàn)了另外的峰，則要么是非特異性擴(kuò)增，要么是引物二聚體

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8樓2012-03-16 16:47:00

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8樓: Originally posted by 小貓三兩只 at 2012-03-16 16:47:00:
陰性對照沒有模板，只有引物，怎么會有帶？所以不會是引物二聚體，應(yīng)該是你的體系污染。如果你的樣品擴(kuò)增過程中出現(xiàn)了另外的峰，則要么是非特異性擴(kuò)增，要么是引物二聚體

謝謝，引物二聚體和模板有關(guān)系嗎？能不能說明是引物設(shè)計(jì)的事。我樣品是單一峰

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9樓2012-03-16 18:12:34

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7樓: Originally posted by andyzhengwp at 2012-03-16 12:43:38:
閾值是不用調(diào)的，機(jī)器自動生成，一般只有一個(gè)峰，如果出現(xiàn)兩個(gè)峰有可能是引物二聚體，或者是加樣出現(xiàn)了問題

那為啥機(jī)器還要設(shè)手動閥值呢？

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10樓2012-03-16 18:14:07

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11樓: Originally posted by shaquila at 2012-03-17 00:13:21:
只要在指數(shù)期就可以，手動自動都行。要矯正不同板的數(shù)據(jù)有兩種方法。一種就是設(shè)定一個(gè)共有樣品為calibrator。另一種就是將數(shù)據(jù)結(jié)果即ct扣除整板數(shù)據(jù)的平均ct，但是這要求你設(shè)置板的時(shí)候是隨機(jī)分配樣品的。

不是很懂。是否是根據(jù)共有樣品的樣本來調(diào)還是怎么著？因?yàn)楣灿袠颖綜t值一樣的很少哈。就說我那個(gè)實(shí)驗(yàn)吧，怎么合在一起，謝謝

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12樓2012-03-17 15:42:55

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