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小鳥劍客金蟲 (小有名氣)
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[求助]
PCR擴啟動子序列的問題
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我要擴3200bp的啟動子片段，結(jié)果用了TAKARA公司的rtaq和PrimeSTARMax聚合酶和TRANSGENE的HiFi酶都跑出來整片的彌散帶且沒有主帶（從100-15000都是彌散的）用TAKARA的LA taq則跑出來另外的片段，求高手相助。 經(jīng)歷：這個片段的引物我去年跑了半年了沒問題，以前都可以跑出來回收的，今年來的時候第一次做也沒問題，到第二次做的時候就跑出彌散帶了，以后1個半月都跑不出主帶來。1.我以為是引物的問題，用了新引物，跟以前的一對引物一起跑，結(jié)果還是沒主帶。2.可能是水的問題，換水也沒結(jié)果。3.重提了3次DNA，前兩次用TRANSGENE的DNA提取試劑盒，如圖1中所示。后一次是用CTAB法提的。結(jié)果兩次的提的DNA只有LA taq酶跑出那個奇怪的帶4.DNTP和buffer都是配套使用的，也沒有什么問題5.給引物和模板給4個人，分別作都是彌散帶。6.反應(yīng)體系15ul.25ul.20ul.50ul都跑過，結(jié)果都不好。PCR程序以rTaq為例： 1.94℃ 5m 2.94℃ 50s 3.60℃ 50s(華大建議的正反引物溫度為64℃和66.7℃) 4.72℃ 3m30s 2 35 5.72℃ 10m 6.4℃ 1h LA taq酶跑出的怪帶的程序是 1.94℃ 5m 2.94℃ 1m 3.72℃ 2m (溫度是每個循環(huán)降0.5℃) 4.72℃ 4m 2 15 5.94℃ 1m 6.65℃ 2m 7.72 ℃ 3m30s 5 25 8.72 ℃ 10m 9.4 ℃ 1h 求高手幫忙解決下啊，快瘋了 |
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2012-03-14 13:32:53, 83 K
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