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yabxxh木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
遇到大麻煩了，將一個(gè)3.1k的片段連入4.5k的載體，請(qǐng)教各位有沒(méi)有什么好方法
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如題，有沒(méi)有人做過(guò)這樣的試驗(yàn)，還請(qǐng)多多賜教。 情況如下： 片段K，大小3.1k，已經(jīng)連接入T載體，并測(cè)序正確。 載體A，大小4.7k，此載體為AAV載體（2型單鏈）pAAV-MCS，其最大裝載容量4.7k，有國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道可以裝載5.2k的表達(dá)質(zhì)粒。其說(shuō)明書(shū)上說(shuō)，最大插入片段為3k（按病毒包裝上限，也就是兩個(gè)ITR之間的序列）。我計(jì)算了一下，載體自身ITR之間的序列（包括CMV，beta globin intron和hGH pA）大小為1758bp，加上我的片段4815bp。 更為嚴(yán)重的是，老板讓兩星期搞定，目前手頭沒(méi)有其他的載體，改造載體（替換短的終止序列）也不太現(xiàn)實(shí)。拿給公司去做，沒(méi)有任何一個(gè)公司敢接。 目前，我已經(jīng)用紫外分光光度計(jì)定量了回收載體和片段，精確算出其摩爾數(shù)，考慮到是大片段連接，位阻效應(yīng)比較嚴(yán)重，所以采用載體0.03pmol：片段0.3pmol的比例進(jìn)行了12小時(shí)，24小時(shí)和48小時(shí)的連接、轉(zhuǎn)化，結(jié)果只有24小時(shí)的有克隆，但是鑒定都為假陽(yáng)性。 感受態(tài)用的是全式金的九次方轉(zhuǎn)化效率的T1，連接酶是TAKARA的Ligation Kit2.0，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照沒(méi)有問(wèn)題。 下一步我打算用載體和片段的摩爾比梯度試一下。 各位有什么好的建議，好的經(jīng)驗(yàn)，或者有哪位仁兄做過(guò)類(lèi)似的試驗(yàn)，還請(qǐng)多多賜教！ |
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3樓2012-03-16 16:51:52
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4樓2012-03-17 19:50:51
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
yabxxh: 金幣+20, ★★★很有幫助, 做了七八年分子，以前都是估算的，后來(lái)發(fā)現(xiàn)還是儀器更準(zhǔn)寫(xiě)，12,24,48都試了，還是不行，感謝提供思路 2012-03-17 22:28:54
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yabxxh: 金幣+20, ★★★很有幫助, 做了七八年分子，以前都是估算的，后來(lái)發(fā)現(xiàn)還是儀器更準(zhǔn)寫(xiě)，12,24,48都試了，還是不行，感謝提供思路 2012-03-17 22:28:54
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（1）3.1K和4.5K連接不是很難。 （2）連接前的片段最好是電泳檢測(cè)一下，和Marker比較一下亮度，可估算出大致的濃度。同時(shí)看一下片段是否是純的，有沒(méi)有雜帶什么的。分光光度儀測(cè)的時(shí)候誤差比較大。 （3）做連接反應(yīng)，可以適當(dāng)增加連接酶濃度，一般16度過(guò)夜即可。 |
5樓2012-03-17 20:08:14
yabxxh
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6樓2012-03-17 22:23:35
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