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yabxxh木蟲 (正式寫手)
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[求助]
遇到大麻煩了，將一個3.1k的片段連入4.5k的載體，請教各位有沒有什么好方法
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如題，有沒有人做過這樣的試驗，還請多多賜教。 情況如下： 片段K，大小3.1k，已經(jīng)連接入T載體，并測序正確。 載體A，大小4.7k，此載體為AAV載體（2型單鏈）pAAV-MCS，其最大裝載容量4.7k，有國外文獻(xiàn)報道可以裝載5.2k的表達(dá)質(zhì)粒。其說明書上說，最大插入片段為3k（按病毒包裝上限，也就是兩個ITR之間的序列）。我計算了一下，載體自身ITR之間的序列（包括CMV，beta globin intron和hGH pA）大小為1758bp，加上我的片段4815bp。 更為嚴(yán)重的是，老板讓兩星期搞定，目前手頭沒有其他的載體，改造載體（替換短的終止序列）也不太現(xiàn)實。拿給公司去做，沒有任何一個公司敢接。 目前，我已經(jīng)用紫外分光光度計定量了回收載體和片段，精確算出其摩爾數(shù)，考慮到是大片段連接，位阻效應(yīng)比較嚴(yán)重，所以采用載體0.03pmol：片段0.3pmol的比例進(jìn)行了12小時，24小時和48小時的連接、轉(zhuǎn)化，結(jié)果只有24小時的有克隆，但是鑒定都為假陽性。 感受態(tài)用的是全式金的九次方轉(zhuǎn)化效率的T1，連接酶是TAKARA的Ligation Kit2.0，陽性對照和陰性對照沒有問題。 下一步我打算用載體和片段的摩爾比梯度試一下。 各位有什么好的建議，好的經(jīng)驗，或者有哪位仁兄做過類似的試驗，還請多多賜教！ |
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yabxxh
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2樓2012-03-16 13:33:03
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3樓2012-03-16 16:51:52
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
yabxxh: 金幣+20, ★★★很有幫助, 做了七八年分子，以前都是估算的，后來發(fā)現(xiàn)還是儀器更準(zhǔn)寫，12,24,48都試了，還是不行，感謝提供思路 2012-03-17 22:28:54
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yabxxh: 金幣+20, ★★★很有幫助, 做了七八年分子，以前都是估算的，后來發(fā)現(xiàn)還是儀器更準(zhǔn)寫，12,24,48都試了，還是不行，感謝提供思路 2012-03-17 22:28:54
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（1）3.1K和4.5K連接不是很難。 （2）連接前的片段最好是電泳檢測一下，和Marker比較一下亮度，可估算出大致的濃度。同時看一下片段是否是純的，有沒有雜帶什么的。分光光度儀測的時候誤差比較大。 （3）做連接反應(yīng)，可以適當(dāng)增加連接酶濃度，一般16度過夜即可。 |
5樓2012-03-17 20:08:14
yabxxh
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6樓2012-03-17 22:23:35
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7樓2012-03-17 22:32:49
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telomerase: 金幣+1, 謝謝你的熱心應(yīng)助 2012-03-19 11:12:18
yabxxh: 金幣+50, ★★★很有幫助, 那篇文章我看了，貌似挺簡單的，不過作為插入片段PCR的質(zhì)粒模版好像要甲基化，我們平常的質(zhì)粒提出來就是甲基化的吧 2012-03-20 11:07:30
telomerase: 金幣+1, 謝謝你的熱心應(yīng)助 2012-03-19 11:12:18
yabxxh: 金幣+50, ★★★很有幫助, 那篇文章我看了，貌似挺簡單的，不過作為插入片段PCR的質(zhì)粒模版好像要甲基化，我們平常的質(zhì)粒提出來就是甲基化的吧 2012-03-20 11:07:30
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下面這篇文章是最新發(fā)在BMC上的，看起來挺好用的。我還沒有試過，你可以試試看： FastCloning: a highly simplified, purification-free, sequence- and ligation-independent PCR cloning method http://www.biomedcentral.com/1472-6750/11/92/ 祝實驗順利 |
8樓2012-03-18 14:09:12
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10樓2012-03-19 10:16:50
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