 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 2009 | 回復(fù): 10 | ||
yabxxh木蟲 (正式寫手)
|
[求助]
遇到大麻煩了，將一個(gè)3.1k的片段連入4.5k的載體，請(qǐng)教各位有沒有什么好方法
|
|
如題，有沒有人做過這樣的試驗(yàn)，還請(qǐng)多多賜教。 情況如下： 片段K，大小3.1k，已經(jīng)連接入T載體，并測(cè)序正確。 載體A，大小4.7k，此載體為AAV載體（2型單鏈）pAAV-MCS，其最大裝載容量4.7k，有國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道可以裝載5.2k的表達(dá)質(zhì)粒。其說(shuō)明書上說(shuō)，最大插入片段為3k（按病毒包裝上限，也就是兩個(gè)ITR之間的序列）。我計(jì)算了一下，載體自身ITR之間的序列（包括CMV，beta globin intron和hGH pA）大小為1758bp，加上我的片段4815bp。 更為嚴(yán)重的是，老板讓兩星期搞定，目前手頭沒有其他的載體，改造載體（替換短的終止序列）也不太現(xiàn)實(shí)。拿給公司去做，沒有任何一個(gè)公司敢接。 目前，我已經(jīng)用紫外分光光度計(jì)定量了回收載體和片段，精確算出其摩爾數(shù)，考慮到是大片段連接，位阻效應(yīng)比較嚴(yán)重，所以采用載體0.03pmol：片段0.3pmol的比例進(jìn)行了12小時(shí)，24小時(shí)和48小時(shí)的連接、轉(zhuǎn)化，結(jié)果只有24小時(shí)的有克隆，但是鑒定都為假陽(yáng)性。 感受態(tài)用的是全式金的九次方轉(zhuǎn)化效率的T1，連接酶是TAKARA的Ligation Kit2.0，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照沒有問題。 下一步我打算用載體和片段的摩爾比梯度試一下。 各位有什么好的建議，好的經(jīng)驗(yàn)，或者有哪位仁兄做過類似的試驗(yàn)，還請(qǐng)多多賜教！ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
求調(diào)劑院校信息
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
085600材料與化工306
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
286求調(diào)劑
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
328求調(diào)劑，英語(yǔ)六級(jí)551，有科研經(jīng)歷
已經(jīng)有9人回復(fù)
-
一志愿北京化工大學(xué)070300 學(xué)碩336求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
286分人工智能專業(yè)請(qǐng)求調(diào)劑愿意跨考！
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
資源與環(huán)境 調(diào)劑申請(qǐng)(333分)
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
280求調(diào)劑
已經(jīng)有12人回復(fù)
-
269專碩求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
材料學(xué)碩301分求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 請(qǐng)教各位大神，用什么軟件建納米管模型？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 遇到麻煩事情了，反應(yīng)后處理的問題？
已經(jīng)有23人回復(fù)
- 麻煩幫助下載3個(gè)文檔
已經(jīng)有1人回復(fù)
- 請(qǐng)教大家一個(gè)有關(guān)載體構(gòu)建的問題，金幣多多~~
已經(jīng)有31人回復(fù)
- 【求助】實(shí)驗(yàn)過程遇到的麻煩情況！請(qǐng)教各位集思廣益幫忙解決！
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 【求助/交流】克隆5k片段
已經(jīng)有9人回復(fù)
yabxxh
木蟲 (正式寫手)
- BioEPI: 11
- 應(yīng)助: 22 (小學(xué)生)
- 貴賓: 0.005
- 金幣: 2238
- 散金: 98
- 紅花: 9
- 帖子: 465
- 在線: 88.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 157001
- 注冊(cè): 2006-01-05
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
2樓2012-03-16 13:33:03
brightfuture01
木蟲之王 (文壇精英)
我愛打老虎
- BioEPI: 8
- 應(yīng)助: 24 (小學(xué)生)
- 貴賓: 1.2
- 金幣: 113358
- 散金: 1526
- 紅花: 224
- 沙發(fā): 1
- 帖子: 28943
- 在線: 3684.8小時(shí)
- 蟲號(hào): 464575
- 注冊(cè): 2007-11-21
- 性別: GG
- 專業(yè): 神經(jīng)生物學(xué)
3樓2012-03-16 16:51:52
cxl_yll
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 22 (小學(xué)生)
- 金幣: 3380.5
- 散金: 17
- 紅花: 5
- 帖子: 982
- 在線: 316小時(shí)
- 蟲號(hào): 843397
- 注冊(cè): 2009-09-08
- 專業(yè): 抗腫瘤藥物藥理
4樓2012-03-17 19:50:51
muyanshuang
木蟲 (正式寫手)
- BioEPI: 1
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 3652.5
- 紅花: 3
- 帖子: 673
- 在線: 257小時(shí)
- 蟲號(hào): 245817
- 注冊(cè): 2006-04-29
- 性別: GG
- 專業(yè): 發(fā)育生物學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
yabxxh: 金幣+20, ★★★很有幫助, 做了七八年分子，以前都是估算的，后來(lái)發(fā)現(xiàn)還是儀器更準(zhǔn)寫，12,24,48都試了，還是不行，感謝提供思路 2012-03-17 22:28:54
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
yabxxh: 金幣+20, ★★★很有幫助, 做了七八年分子，以前都是估算的，后來(lái)發(fā)現(xiàn)還是儀器更準(zhǔn)寫，12,24,48都試了，還是不行，感謝提供思路 2012-03-17 22:28:54
|
（1）3.1K和4.5K連接不是很難。 （2）連接前的片段最好是電泳檢測(cè)一下，和Marker比較一下亮度，可估算出大致的濃度。同時(shí)看一下片段是否是純的，有沒有雜帶什么的。分光光度儀測(cè)的時(shí)候誤差比較大。 （3）做連接反應(yīng)，可以適當(dāng)增加連接酶濃度，一般16度過夜即可。 |
5樓2012-03-17 20:08:14
yabxxh
木蟲 (正式寫手)
- BioEPI: 11
- 應(yīng)助: 22 (小學(xué)生)
- 貴賓: 0.005
- 金幣: 2238
- 散金: 98
- 紅花: 9
- 帖子: 465
- 在線: 88.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 157001
- 注冊(cè): 2006-01-05
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
6樓2012-03-17 22:23:35
yabxxh
木蟲 (正式寫手)
- BioEPI: 11
- 應(yīng)助: 22 (小學(xué)生)
- 貴賓: 0.005
- 金幣: 2238
- 散金: 98
- 紅花: 9
- 帖子: 465
- 在線: 88.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 157001
- 注冊(cè): 2006-01-05
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
7樓2012-03-17 22:32:49
brightfuture01
木蟲之王 (文壇精英)
我愛打老虎
- BioEPI: 8
- 應(yīng)助: 24 (小學(xué)生)
- 貴賓: 1.2
- 金幣: 113358
- 散金: 1526
- 紅花: 224
- 沙發(fā): 1
- 帖子: 28943
- 在線: 3684.8小時(shí)
- 蟲號(hào): 464575
- 注冊(cè): 2007-11-21
- 性別: GG
- 專業(yè): 神經(jīng)生物學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
telomerase: 金幣+1, 謝謝你的熱心應(yīng)助 2012-03-19 11:12:18
yabxxh: 金幣+50, ★★★很有幫助, 那篇文章我看了，貌似挺簡(jiǎn)單的，不過作為插入片段PCR的質(zhì)粒模版好像要甲基化，我們平常的質(zhì)粒提出來(lái)就是甲基化的吧 2012-03-20 11:07:30
telomerase: 金幣+1, 謝謝你的熱心應(yīng)助 2012-03-19 11:12:18
yabxxh: 金幣+50, ★★★很有幫助, 那篇文章我看了，貌似挺簡(jiǎn)單的，不過作為插入片段PCR的質(zhì)粒模版好像要甲基化，我們平常的質(zhì)粒提出來(lái)就是甲基化的吧 2012-03-20 11:07:30
|
下面這篇文章是最新發(fā)在BMC上的，看起來(lái)挺好用的。我還沒有試過，你可以試試看： FastCloning: a highly simplified, purification-free, sequence- and ligation-independent PCR cloning method http://www.biomedcentral.com/1472-6750/11/92/ 祝實(shí)驗(yàn)順利 |
8樓2012-03-18 14:09:12
小灰灰128
金蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 7 (幼兒園)
- 金幣: 1210.2
- 紅花: 1
- 帖子: 301
- 在線: 103.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 1512428
- 注冊(cè): 2011-11-27
- 性別: GG
- 專業(yè): 腫瘤病因
9樓2012-03-18 21:54:41
bdpnx
銅蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 194.6
- 帖子: 83
- 在線: 56.8小時(shí)
- 蟲號(hào): 297625
- 注冊(cè): 2006-11-18
- 性別: GG
- 專業(yè): 畜牧學(xué)
10樓2012-03-19 10:16:50
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 yabxxh 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 初試 317 +7 | 半拉月丙 2026-03-20 | 7/350 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿西安交通大學(xué)材料工程專業(yè) 282分求調(diào)劑 +10 | 楓橋ZL 2026-03-18 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | 白QF 2026-03-21 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 330求調(diào)劑0854 +3 | assdll 2026-03-21 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 332求調(diào)劑 +3 | 鳳凰院丁真 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 化學(xué)求調(diào)劑 +4 | 臨澤境llllll 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 265求調(diào)劑 +9 | 梁梁校校 2026-03-17 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 考研調(diào)劑求學(xué)校推薦 +3 | 伯樂29 2026-03-18 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿 西北大學(xué) ，070300化學(xué)學(xué)碩，總分287，雙非一本，求調(diào)劑。 +4 | 晨昏線與星海 2026-03-19 | 4/200 |
|
|
|
[考博] 招收博士1-2人 +3 | QGZDSYS 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 288求調(diào)劑，一志愿華南理工大學(xué)071005 +5 | ioodiiij 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料專碩306英一數(shù)二 +10 | z1z2z3879 2026-03-16 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 312求調(diào)劑 +8 | 陌宸希 2026-03-16 | 9/450 |
|
|
|
[考研]
 0854，計(jì)算機(jī)類招收調(diào)劑
+3
|
胡辣湯放糖 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +11 | zjl的號(hào) 2026-03-16 | 16/800 |
|
|
|
[考博] 26博士申請(qǐng) +3 | 1042136743 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 考研求調(diào)劑 +3 | 橘頌. 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +4 | 是Lupa啊 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +3 | 聽風(fēng)就是雨； 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085601材料工程315分求調(diào)劑 +3 | yang_0104 2026-03-15 | 3/150 |
|