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hyacinth326金蟲 (正式寫手)
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[求助]
請教大家一個(gè)有關(guān)載體構(gòu)建的問題，金幣多多~~
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各位兄弟姐們大家好，我想請教一個(gè)關(guān)于載體構(gòu)建的問題，因?yàn)檫@個(gè)載體已經(jīng)構(gòu)建了半年了，一直不成功，我們導(dǎo)師私底下說，如果我再構(gòu)建不成功的話，就只能說明我能力有問題了，所以大家一定多幫幫我，我不想被別人說成是能力問題。 首先介紹一下基本情況吧：我想構(gòu)建一個(gè)載體，包含兩個(gè)片段，片段一：還有一個(gè)質(zhì)粒的溫度敏感復(fù)制區(qū)和復(fù)制蛋白，在這個(gè)片段的選擇上我認(rèn)為是應(yīng)該沒有問題的，因?yàn)槲沂峭ㄟ^要用做模板的這個(gè)質(zhì)粒與構(gòu)建這個(gè)質(zhì)粒的原始質(zhì)粒進(jìn)行比對選取的，將pcr出來的目的片段連接到克隆載體上。片段二：是一個(gè)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，抗生素序列還有蔗糖致死基因，這個(gè)片段pcr獲得之后就連到克隆載體上了，并且抗生素抗性和蔗糖致死功能都驗(yàn)證了沒有問題。然后我將這兩個(gè)連接到克隆載體上的片段切下來，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，結(jié)果試了很多次都沒有陽性轉(zhuǎn)化子。 我用的限制性內(nèi)切酶是NcoI和XhoI，實(shí)在找不出原因了，麻煩大家?guī)兔Ψ治鲆幌驴赡艽嬖诘脑虬桑绻芙鉀Q問題，小女子甘愿奉上所有金幣，只為爭一口氣。 |
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gyesang
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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如果你用Overlap做的話，真的非常容易，根據(jù)上面的描述，你分別PCR到兩個(gè)片段，然后連入載體，再分別切下來，三片段連入目標(biāo)載體，三片段連不是不可以，但是效率要低很多。 假若按你的方法，你說結(jié)果試了很多次都沒有陽性轉(zhuǎn)化子。這個(gè)沒有陽性轉(zhuǎn)化子是什么意思，是平板上不長菌落，還是長的菌落是假的。 如果是假的，你有分析原因嗎，是因?yàn)檩d體沒有被雙酶切開嗎？如果載體被酶切的很干凈的話，三片段連也是很好連的。 既然你的老板催的比較緊，你不妨overlap一試，就是花的合成引物的錢嘛。 |
8樓2013-04-02 19:55:44
2樓2013-03-31 22:50:22
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
hyacinth326: 金幣+5, ★★★很有幫助, 多謝關(guān)注 2013-04-01 12:23:43
hyacinth326: 金幣+5, ★★★很有幫助, 多謝關(guān)注 2013-04-01 12:23:43
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首先，確認(rèn)抗生素基因片段是否完整（有的時(shí)候，特別是有兩種抗性的，其中1種可能并不完整），以及是否有可能用錯(cuò)， 第2，設(shè)對照，證明感受態(tài)沒問題 第3，確認(rèn)致死基因沒有表達(dá)（如果確認(rèn)理論上沒有表達(dá)，那么考慮培養(yǎng)基的組分是否可能含有極少量的誘導(dǎo)物，不行就借別人的平板試試）， 第4，建議先用overlap PCR 將兩個(gè)片段 連接，回收目的長度的片段后再連接載體，每一步都要有確切的電泳照片，大小一定要對才行！ 先試試看，再說。 |
3樓2013-03-31 23:04:05
hyacinth326
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7樓2013-04-02 10:22:32
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9樓2013-04-02 20:07:32
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【答案】應(yīng)助回帖
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不好意思，的確實(shí)我看錯(cuò)， 你的這個(gè)兩個(gè)片段分別多大哈 質(zhì)粒的溫度敏感復(fù)制區(qū)和復(fù)制蛋白 多克隆位點(diǎn)，抗生素序列還有蔗糖致死基因 沒有陽性轉(zhuǎn)化子有沒有可能跟你的培養(yǎng)條件有關(guān)，比如溫度，因?yàn)槟氵@是溫度敏感，營養(yǎng)，因?yàn)槟氵@是蔗糖致死，所以你有沒有必要check一下這個(gè) |
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hyacinth32610樓2013-04-02 20:51:17
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