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hyacinth326金蟲 (正式寫手)
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[求助]
請(qǐng)教大家一個(gè)有關(guān)載體構(gòu)建的問(wèn)題，金幣多多~~
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各位兄弟姐們大家好，我想請(qǐng)教一個(gè)關(guān)于載體構(gòu)建的問(wèn)題，因?yàn)檫@個(gè)載體已經(jīng)構(gòu)建了半年了，一直不成功，我們導(dǎo)師私底下說(shuō)，如果我再構(gòu)建不成功的話，就只能說(shuō)明我能力有問(wèn)題了，所以大家一定多幫幫我，我不想被別人說(shuō)成是能力問(wèn)題。 首先介紹一下基本情況吧：我想構(gòu)建一個(gè)載體，包含兩個(gè)片段，片段一：還有一個(gè)質(zhì)粒的溫度敏感復(fù)制區(qū)和復(fù)制蛋白，在這個(gè)片段的選擇上我認(rèn)為是應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題的，因?yàn)槲沂峭ㄟ^(guò)要用做模板的這個(gè)質(zhì)粒與構(gòu)建這個(gè)質(zhì)粒的原始質(zhì)粒進(jìn)行比對(duì)選取的，將pcr出來(lái)的目的片段連接到克隆載體上。片段二：是一個(gè)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，抗生素序列還有蔗糖致死基因，這個(gè)片段pcr獲得之后就連到克隆載體上了，并且抗生素抗性和蔗糖致死功能都驗(yàn)證了沒(méi)有問(wèn)題。然后我將這兩個(gè)連接到克隆載體上的片段切下來(lái)，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，結(jié)果試了很多次都沒(méi)有陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。 我用的限制性內(nèi)切酶是NcoI和XhoI，實(shí)在找不出原因了，麻煩大家?guī)兔Ψ治鲆幌驴赡艽嬖诘脑虬�，如果能解決問(wèn)題，小女子甘愿奉上所有金幣，只為爭(zhēng)一口氣。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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hyacinth326: 金幣+5, ★★★很有幫助, 多謝關(guān)注 2013-04-01 12:23:43
hyacinth326: 金幣+5, ★★★很有幫助, 多謝關(guān)注 2013-04-01 12:23:43
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首先，確認(rèn)抗生素基因片段是否完整（有的時(shí)候，特別是有兩種抗性的，其中1種可能并不完整），以及是否有可能用錯(cuò)， 第2，設(shè)對(duì)照，證明感受態(tài)沒(méi)問(wèn)題 第3，確認(rèn)致死基因沒(méi)有表達(dá)（如果確認(rèn)理論上沒(méi)有表達(dá)，那么考慮培養(yǎng)基的組分是否可能含有極少量的誘導(dǎo)物，不行就借別人的平板試試）， 第4，建議先用overlap PCR 將兩個(gè)片段 連接，回收目的長(zhǎng)度的片段后再連接載體，每一步都要有確切的電泳照片，大小一定要對(duì)才行！ 先試試看，再說(shuō)。 |
3樓2013-03-31 23:04:05
2樓2013-03-31 22:50:22
hyacinth326
金蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 74 (初中生)
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多謝你的關(guān)注 抗生素是沒(méi)有問(wèn)題的，因?yàn)槲覍⒑锌股氐钠芜B接到載體上之后驗(yàn)證了抗生素的功能。 感受態(tài)是沒(méi)有問(wèn)題的，我自己做的，而且驗(yàn)證了之后再做的實(shí)驗(yàn)。 蔗糖致死基因在沒(méi)有蔗糖存在的條件下，是不致死的，我的平板就是LB+抗生素，所以這個(gè)應(yīng)該也沒(méi)有問(wèn)題。 第四個(gè)問(wèn)題我不太懂，我是想把兩個(gè)片段連接成一個(gè)載體，這兩個(gè)片段我已經(jīng)連接到克隆載體上了，為什么還得overlap呢？ |
4樓2013-04-01 12:22:54
hyacinth326
金蟲 (正式寫手)
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5樓2013-04-01 12:28:39
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