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hyacinth326金蟲 (正式寫手)
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[求助]
請教大家一個有關載體構建的問題，金幣多多~~
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各位兄弟姐們大家好，我想請教一個關于載體構建的問題，因為這個載體已經構建了半年了，一直不成功，我們導師私底下說，如果我再構建不成功的話，就只能說明我能力有問題了，所以大家一定多幫幫我，我不想被別人說成是能力問題。 首先介紹一下基本情況吧：我想構建一個載體，包含兩個片段，片段一：還有一個質粒的溫度敏感復制區(qū)和復制蛋白，在這個片段的選擇上我認為是應該沒有問題的，因為我是通過要用做模板的這個質粒與構建這個質粒的原始質粒進行比對選取的，將pcr出來的目的片段連接到克隆載體上。片段二：是一個質粒的多克隆位點，抗生素序列還有蔗糖致死基因，這個片段pcr獲得之后就連到克隆載體上了，并且抗生素抗性和蔗糖致死功能都驗證了沒有問題。然后我將這兩個連接到克隆載體上的片段切下來，連接轉化大腸桿菌感受態(tài)，結果試了很多次都沒有陽性轉化子。 我用的限制性內切酶是NcoI和XhoI，實在找不出原因了，麻煩大家?guī)兔Ψ治鲆幌驴赡艽嬖诘脑虬�，如果能解決問題，小女子甘愿奉上所有金幣，只為爭一口氣。 |
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gyesang
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8樓2013-04-02 19:55:44
2樓2013-03-31 22:50:22
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★
hyacinth326: 金幣+5, ★★★很有幫助, 多謝關注 2013-04-01 12:23:43
hyacinth326: 金幣+5, ★★★很有幫助, 多謝關注 2013-04-01 12:23:43
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首先，確認抗生素基因片段是否完整（有的時候，特別是有兩種抗性的，其中1種可能并不完整），以及是否有可能用錯， 第2，設對照，證明感受態(tài)沒問題 第3，確認致死基因沒有表達（如果確認理論上沒有表達，那么考慮培養(yǎng)基的組分是否可能含有極少量的誘導物，不行就借別人的平板試試）， 第4，建議先用overlap PCR 將兩個片段 連接，回收目的長度的片段后再連接載體，每一步都要有確切的電泳照片，大小一定要對才行！ 先試試看，再說。 |
3樓2013-03-31 23:04:05
hyacinth326
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4樓2013-04-01 12:22:54
hyacinth326
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5樓2013-04-01 12:28:39
6樓2013-04-02 10:12:58
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7樓2013-04-02 10:22:32
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9樓2013-04-02 20:07:32
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【答案】應助回帖
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不好意思，的確實我看錯， 你的這個兩個片段分別多大哈 質粒的溫度敏感復制區(qū)和復制蛋白 多克隆位點，抗生素序列還有蔗糖致死基因 沒有陽性轉化子有沒有可能跟你的培養(yǎng)條件有關，比如溫度，因為你這是溫度敏感，營養(yǎng)，因為你這是蔗糖致死，所以你有沒有必要check一下這個 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
hyacinth32610樓2013-04-02 20:51:17
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