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l20065091新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助，為什么SSR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖跑出的條帶會(huì)比maker最大分子量還要大呢？？
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我做紅藻微衛(wèi)星標(biāo)記的，先用溫度梯度找到合適的退火溫度后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增的，引物來(lái)源有EST設(shè)計(jì)和同科屬的不同物種，產(chǎn)物應(yīng)該在500bp以下才對(duì)的哇？我maker用的DL1000的，瓊脂糖為1%濃度，100V電泳30min，電泳后發(fā)現(xiàn)，PCR擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物居然比maker最大分子量還要大，有的是同科屬的不同物種的引物，這種情況不止一對(duì)引物出現(xiàn)，多對(duì)引物都出現(xiàn)，請(qǐng)問到底哪里出問題了？下面是我的PCR程序和體系，謝謝指教�。�！ PCR程序：94度 5min 94度50s 退火溫度 45s 72度 50s 30個(gè)循環(huán) 72度 8min PCR體系25ul：Buffer 2.5ul dntp 2ul Mgcl2 1.5ul F 0.8ul R 0.8ul Taq 0.3ul 加水至25ul 同一個(gè)科的近緣物種的引物擴(kuò)增 本物種引物擴(kuò)增 |
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rommel1941
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
amisking: 金幣+3, 鼓勵(lì)幫助解答問題！ 2012-03-22 18:37:37
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建議繼續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)條件，非特異擴(kuò)增很嚴(yán)重，主要從Tm和Mg入手比較好。 我所做的SSR標(biāo)記確實(shí)沒出現(xiàn)過這種情況，你可以把比較亮的條帶切膠回收，然后測(cè)序，看看是什么東東。 作微衛(wèi)星不要這么長(zhǎng)的退火時(shí)間和延長(zhǎng)時(shí)間，一般控制在10-30s就好。我的試驗(yàn)條件是94度 4min；94度30s，退火溫度 20s，72度 30s 30個(gè)循環(huán)；72度 2min。因?yàn)槲⑿l(wèi)星的長(zhǎng)度都很小，太長(zhǎng)的退火和延伸，可能會(huì)帶來(lái)較強(qiáng)的非特異擴(kuò)增。希望對(duì)你有幫助，祝好。 |
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l20065091
2樓2012-03-22 16:47:14
l20065091
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3樓2012-03-22 20:16:02
rommel1941
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4樓2012-03-22 22:29:14
l20065091
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5樓2012-03-23 21:04:28
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【答案】應(yīng)助回帖
| 一般鎂離子多了容易出雜帶，但樓主的大分子量條帶看亮度應(yīng)該屬于主帶級(jí)別的，這種情況調(diào)整PCR體系或程序解決不了根本問題。具體問題在哪有待商榷，個(gè)人認(rèn)為最大的問題可能還是出在引物上，因?yàn)闃侵饔姓f(shuō)多對(duì)引物出現(xiàn)該問題，這就說(shuō)明也有部分引物正常，同意樓上切膠回收測(cè)序的想法，也可用一個(gè)在大一些的marker先確認(rèn)擴(kuò)增條帶的分子量再做進(jìn)一步分析。不要片面的否認(rèn)自己的結(jié)果。此外還有可能存在問題的就是你的DNA樣品。 |
6樓2013-05-26 01:33:04
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本帖內(nèi)容被屏蔽 |
7樓2014-06-07 16:42:35
紅色和藍(lán)色
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8樓2019-07-31 19:19:00
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