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l20065091新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助，為什么SSR擴增產(chǎn)物瓊脂糖跑出的條帶會比maker最大分子量還要大呢？？
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我做紅藻微衛(wèi)星標(biāo)記的，先用溫度梯度找到合適的退火溫度后再進行PCR擴增的，引物來源有EST設(shè)計和同科屬的不同物種，產(chǎn)物應(yīng)該在500bp以下才對的哇？我maker用的DL1000的，瓊脂糖為1%濃度，100V電泳30min，電泳后發(fā)現(xiàn)，PCR擴增出來的產(chǎn)物居然比maker最大分子量還要大，有的是同科屬的不同物種的引物，這種情況不止一對引物出現(xiàn)，多對引物都出現(xiàn)，請問到底哪里出問題了？下面是我的PCR程序和體系，謝謝指教！��！ PCR程序：94度 5min 94度50s 退火溫度 45s 72度 50s 30個循環(huán) 72度 8min PCR體系25ul：Buffer 2.5ul dntp 2ul Mgcl2 1.5ul F 0.8ul R 0.8ul Taq 0.3ul 加水至25ul 同一個科的近緣物種的引物擴增 本物種引物擴增 |
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l20065091
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rommel1941
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
amisking: 金幣+3, 鼓勵幫助解答問題！ 2012-03-22 18:37:37
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建議繼續(xù)優(yōu)化試驗條件，非特異擴增很嚴(yán)重，主要從Tm和Mg入手比較好。 我所做的SSR標(biāo)記確實沒出現(xiàn)過這種情況，你可以把比較亮的條帶切膠回收，然后測序，看看是什么東東。 作微衛(wèi)星不要這么長的退火時間和延長時間，一般控制在10-30s就好。我的試驗條件是94度 4min；94度30s，退火溫度 20s，72度 30s 30個循環(huán)；72度 2min。因為微衛(wèi)星的長度都很小，太長的退火和延伸，可能會帶來較強的非特異擴增。希望對你有幫助，祝好。 |
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2樓2012-03-22 16:47:14
rommel1941
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5樓2012-03-23 21:04:28
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