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happywyh

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[交流] 引物設(shè)計(jì)

上游1（含信號(hào)肽） 5’—3’ TTGATCATGATTACACGTC
上游2（不含信號(hào)肽） 5’—3’
下游 5’—3’ GATCATTGCAGGATCACTAA
引物設(shè)計(jì)的怎么樣啊，用oligo，primer5分析里面數(shù)據(jù)太多，看不懂~~
oligo PCR分析（圖1），得到的數(shù)據(jù)，覺得數(shù)據(jù)怪怪的，上下游引物退火溫度差不多就好了，干嘛還有個(gè)product Tm呢，總結(jié)論也看不懂
上游引物二聚體分析：圖2
下游引物二聚體分析：圖3
上游錯(cuò)配分析：圖4
看不懂，糾結(jié)~~還請(qǐng)各位賜教
引物分析時(shí)要不要把限制性酶堿基，保護(hù)堿基包括在內(nèi)呀~

圖一（PCR分析）

圖2 上游引物二聚體分析

圖3 下游引物二聚體分析

圖4 上游引物錯(cuò)配率分析

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1樓 2012-03-26 17:09:46

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孫啟亮

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★ ★
西瓜: 金幣+2, Good! 2012-03-28 10:12:47

引用回帖:

8樓: Originally posted by happywyh at 2012-03-27 21:17:50:
沒有模板怎么blast一下？

引物的blast不需要模板，比如說(shuō)假如你想擴(kuò)人IL6，那么把你的引物進(jìn)行blast后NCBI會(huì)告訴你理論上你的引物是否能擴(kuò)出IL6，同時(shí)也會(huì)告訴你你的引物能不能擴(kuò)出除了IL6以外的其他東西，也就是引物的特異性問(wèn)題

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happywyh

9樓2012-03-27 22:33:35

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atlanticwi

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★
happywyh(金幣+1): 謝謝參與

嗯............
引物設(shè)計(jì)來(lái)是做什么下游分析呢
先回答你的第三個(gè)問(wèn)題，分析時(shí)不用管酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，只管結(jié)合與模板的部分

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2樓2012-03-26 17:25:23

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atlanticwi

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★ ★ ★
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 只能說(shuō)，非常感謝對(duì)本版的支持！ 2012-03-27 11:37:58

嗯.............要不這么來(lái)說(shuō)說(shuō)吧
1. 首先不明白你上游引物寫了兩個(gè)，為什么分析中只有一個(gè)，觀察你的序列和引物位置，那么就假設(shè)你P的是某基因的CDS全長(zhǎng)
2. 從PCR分析來(lái)看，兩引物Tm值相差不大，但較不穩(wěn)定引物與產(chǎn)物Tm值相差達(dá)到32.7度，這個(gè)比較致命，因?yàn)楫a(chǎn)物與引物Tm相差過(guò)高，會(huì)引起模板-模板間和模板-引物間的退火競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，Oligo軟件設(shè)計(jì)官方給出的最大差值是不要超過(guò)29度，也有人提出不要超過(guò)20度。所以要不增大你引物長(zhǎng)度，適當(dāng)增加引物Tm值，要不依舊使用此引物但采用高退火溫度去P。
3. 以假定你是需要擴(kuò)CDS來(lái)講，那么上下游的Dimer實(shí)際并不用考慮過(guò)多，只要3‘Dimer不是很嚴(yán)重就可以了，文中觀察你的Dimer中堿基配對(duì)數(shù)量和自由能觀察，你這個(gè)引物基本木有問(wèn)題。
4. 關(guān)于錯(cuò)配，Primer Premier5中是有錯(cuò)配是否能生成產(chǎn)物的結(jié)論，如果沒有，怎么錯(cuò)配了我們都不管，或是錯(cuò)配產(chǎn)物遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于P產(chǎn)物，那么我們也是不管，而Oligo好像是看上頭Primering efficiency的，上游引物第一個(gè)與正義鏈的錯(cuò)配分?jǐn)?shù)較高，但感覺也不會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。
5. 再說(shuō)明一下，需要另加的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基是不算在引物分析之內(nèi)的。
6. 以你就是要P某基因的CDS為例，反正正反開始都限定了，你就選個(gè)合適的引物長(zhǎng)度去P就是了，注意長(zhǎng)度要盡量長(zhǎng)一點(diǎn)，保證高退火下的特異性就可以了。
純屬個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，不足之處或說(shuō)錯(cuò)之處希望高手出現(xiàn)并指正，祝實(shí)驗(yàn)成功

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happywyh

3樓2012-03-26 22:33:37

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3樓: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-26 22:33:37:
嗯.............要不這么來(lái)說(shuō)說(shuō)吧
1. 首先不明白你上游引物寫了兩個(gè)，為什么分析中只有一個(gè)，觀察你的序列和引物位置，那么就假設(shè)你P的是某基因的CDS全長(zhǎng)
2. 從PCR分析來(lái)看，兩引物Tm值相差不大，但較不穩(wěn)定引物 ...

謝謝~~幫助很大
根據(jù)所提的一些要點(diǎn)，我重新設(shè)計(jì)了兩條引物
上游1（含有信號(hào)肽）AAAAAGAACCTGATCATGATTACACGTC
上游2（不含有信號(hào)肽）AGCTTTCCCATCTAGTATTCAA
下游 GATCATTGCAGGATCACTAAAGGAG
上游1：從起始密碼子之前的15個(gè)堿基開始設(shè)計(jì)的
上游2：不含信號(hào)肽的部分不好設(shè)計(jì)，鏈短退火溫度低，鏈長(zhǎng)會(huì)嚴(yán)重的形成3'端二聚體，
這一次的引物設(shè)計(jì)結(jié)果PCR分析數(shù)據(jù)：

[ Last edited by happywyh on 2012-3-27 at 10:37 ]

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5樓2012-03-27 10:35:13

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