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zhnchn銅蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
PCR標(biāo)準(zhǔn)體系有關(guān)問(wèn)題。。求高手解答
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標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系： 10×擴(kuò)增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至 100ul 其中10×擴(kuò)增緩沖液是什么意思啊 前面怎么乘以10了， 4種dNTP混合物 各 200umol/L 這個(gè)200umol/L 不是濃度單位嘛？ 怎么配標(biāo)準(zhǔn)體系最后沒(méi)有需要多少體積的該混合物 且引物的量不是定的嗎？pmol是怎么換算成體積單位的�。� Taq DNA聚合酶 2.5u 這個(gè)單位求解釋的��？ 不懂的唉 Mg2+ 1.5mmol/L 這個(gè)用量也不懂的。。。 問(wèn)下大家配體系的時(shí)候是不是都換成體積單位進(jìn)行試劑配置的 我自己做的PCR,體系所加試劑單位都是體積 剛看到這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)體系 不懂的唉 求高手解答 問(wèn)的低級(jí)問(wèn)題 請(qǐng)勿噴哦。。。 謝謝 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, good！ 2012-03-27 11:33:32
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1.10×的Buffer是酶的反應(yīng)緩沖，是以十倍量保存，反應(yīng)時(shí)要變成1×，所以100ul 體系里加了 10ul 2.dNTP一般是2.5mM的包裝，你買(mǎi)的什么的都會(huì)有說(shuō)明，所以根據(jù)你加的濃度換算成體積 3.引物是自己合成的鏈，這個(gè)根據(jù)你的體系加，還有你當(dāng)初溶鏈時(shí)的濃度，然后根據(jù)你加的濃度換算體積，這個(gè)一般是過(guò)量的 4.酶量的確定可根據(jù)你聚合酶的說(shuō)明書(shū)來(lái)定，U指的是Unit，就是每ul里有多少單位，根據(jù)你酶的活性加入相應(yīng)的體積 5.Mg2+一般不用單獨(dú)加，反應(yīng)Buffer里面有，但是可能這個(gè)反應(yīng)體系需要自己加吧 6.關(guān)于體積問(wèn)題都要根據(jù)你儲(chǔ)備液的濃度以及相應(yīng)你要用的終濃度來(lái)?yè)Q算的 |
2樓2012-03-27 10:26:13
atlanticwi
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
琴美喜歡發(fā)呆 不喜歡發(fā)脾氣
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 還是很熱心哈 2012-03-27 11:35:31
zhnchn: 金幣+1, ★★★很有幫助, 謝謝 有不懂的 再請(qǐng)教你 2012-03-28 00:23:57
西瓜: 金幣+2, MolEPI+1, 每次回帖都很認(rèn)真耐心 2012-04-01 17:14:00
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嗯......木有人噴你了，大家都是這個(gè)階段過(guò)來(lái)的啦 1. 10X的意思是10倍濃縮儲(chǔ)存液，工作液是一般是1X的，所以你總體系如果用100uL，就會(huì)用10uL的緩沖液，最后不是稀釋了10倍嘛~ 2. 4種dNTP混合物，是濃度標(biāo)定的呀，我們一般PCR使用2.5uM（也就是2.5umol/L，但我這里指的是混好的，不是你這種分開(kāi)放的)，用2~3uL就夠了（針對(duì)20uL體系）所以你可以計(jì)算一下，以放大或縮小你需要加的量 3. 引物的量當(dāng)然是定的了，你訂來(lái)的引物需要加水溶解至儲(chǔ)存液（我們用100uM），然后稀釋至工作液（我們一般PCR用10uM），20uL的體系加1uL就夠了，你可以算一下是不是在這個(gè)引物給定范圍內(nèi)。 4. 酶都是按活力單位U給的，不過(guò)也有給你每uL多少U的，你換算成體積（uL）就成了哦 5. Mg離子一般緩沖液會(huì)含有的，但是某些公司就是分開(kāi)裝的，所以遇到這種情況，你把它按你總體系多少換算過(guò)來(lái)需要多少uL Mg離子量 6. 所以配PCR體系都是按照體積加的哦~~~~~~ 如有寫(xiě)錯(cuò)，希望高手指正，祝實(shí)驗(yàn)順利  |
3樓2012-03-27 10:26:41
wubinsean
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4樓2012-03-31 19:50:03
不倒帆
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6樓2022-04-12 15:16:56
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