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[求助]
熒光定量PCR的模板濃度
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| 本人第一次做熒光定量PCR，得到的CT值不是很理想，查閱得CT值在18-22之間比較理想，想問一下，同一批實(shí)驗(yàn)，加看家基因的反應(yīng)液中和加目的基因的反應(yīng)液中的模板濃度可以不同么，以獲得理想的CT值？ |
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孫啟亮
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜: 金幣+3, 歡迎常來~ 2012-03-28 18:41:14
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首先 模板量必須加等量的，這樣內(nèi)參才能對(duì)目的基因相對(duì)定量啊。其次 正常的Ct值范圍為18-30之間，最好為23左右。一般一個(gè)20ul的反應(yīng)體系里模板量最大為1ug。 其次，不知樓主的Ct值是太高還是太低，若是太高，那么說明模板濃度太低，這樣樓主可以在提RNA的時(shí)候調(diào)整RNA濃度；若是太低，說明模板濃度過高，樓主可以適當(dāng)降低模板濃度。若是Ct值太低的話，樓主還可以做個(gè)濃度梯度，這樣既可以得到引物擴(kuò)增效率又可以得到在最佳Ct值下的模板濃度。這樣就對(duì)自己的實(shí)驗(yàn)做到了心里有數(shù)，在以后的實(shí)驗(yàn)中也會(huì)事半功倍 |
5樓2012-03-28 18:25:49
atlanticwi
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-03-28 11:07:57
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西瓜: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-03-28 11:07:57
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個(gè)人看法： 1. 沒有說18-22個(gè)Ct值是合適的，我認(rèn)為在35個(gè)Ct值前都能說明問題（當(dāng)然能這里有涉及Ct值矯正或模板量、闕值等眾多問題），只是30左右的Ct值需要多次實(shí)驗(yàn)確定穩(wěn)定的數(shù)據(jù)結(jié)果后方可用 2. 為什么要內(nèi)參和檢測基因的模板濃度不同，如果不同了的話你如何去標(biāo)準(zhǔn)化你說有的樣品？況且，濃度不同肯定涉及稀釋過程，定量中多任何不必要的步驟都能帶來操作誤差導(dǎo)致不規(guī)范的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。所以不明白你這個(gè)做法有什么意義 希望有所幫助，如有說錯(cuò)，請(qǐng)高手指正 |
2樓2012-03-28 09:30:10
3樓2012-03-28 10:20:13
4樓2012-03-28 16:09:55
6樓2012-03-29 15:50:11
7樓2012-03-29 16:44:19
8樓2012-03-30 13:29:37
孫啟亮
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9樓2012-03-30 15:03:08
10樓2012-03-31 12:34:06
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