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[求助] 關(guān)于RT-PCR的眾多細(xì)節(jié)

我提取的是細(xì)菌的RNA，濃度在500ng/ul左右，但純度很低，260/280只在1.6-1.7之間，請(qǐng)問(wèn)這樣的RNA能用嗎，感覺(jué)細(xì)菌的RNA的260/280好像都很低，沒(méi)有組織和植物的RNA那么好。用這樣的RNA反轉(zhuǎn)錄之后的熒光PCR效果也不錯(cuò)，現(xiàn)在就很糾結(jié)，這種RNA純度能用嗎，請(qǐng)問(wèn)大家提取的細(xì)菌RNA純度都咋樣，我提取RNA的試劑是TAKARA的。
再有一個(gè)現(xiàn)象，提取RNA過(guò)程中添加異丙醇離心后沒(méi)有RNA沉淀，后續(xù)乙醇洗脫時(shí)心里很虛。請(qǐng)問(wèn)大家遇到過(guò)這樣的問(wèn)題嗎？

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1樓 2012-03-28 12:12:32

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狼在身邊: 回帖置頂 2012-03-29 12:41:52

引用回帖:

4樓: Originally posted by huang200669 at 2012-03-28 16:15:12:
我以前試過(guò)，用260/280是2.0、1.8、1.7的RNA分別反轉(zhuǎn)錄做熒光，內(nèi)參的CT值不一樣，2.0的CT值是20，1.7的是28，我的是植物RNA。

CT的大小應(yīng)該和濃度的關(guān)系更大一些吧，你測(cè)定不同260/280CT值時(shí)RNA的濃度一樣嗎？

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8樓2012-03-28 20:28:01

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wtyyyyy1988

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-03-28 15:07:43

紫外分光測(cè)的都不是很準(zhǔn)的，關(guān)鍵看你跑的RNA電泳怎么樣，電泳上跑的好的話就沒(méi)什么大問(wèn)題，不要去在意紫外測(cè)的，如果有DNA污染就用Dnase 1c處理下。
沒(méi)有沉淀是正常的，不要發(fā)虛，吸取的時(shí)候小心點(diǎn)就OK啦，但是最后你一定要跑個(gè)電泳看看啊，千萬(wàn)不要只測(cè)紫外而不跑電泳，兩者結(jié)合最好！
GOOD luck!

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我就是我

2樓2012-03-28 12:58:06

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孫啟亮

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

RNA微量，所以即使看不到沉淀，但是在乙醇洗滌的時(shí)候會(huì)看見(jiàn)的。我也有心虛的時(shí)候，但是在洗滌的時(shí)候總是能看見(jiàn)RNA所以現(xiàn)在也就不心虛了

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3樓2012-03-28 14:45:29

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huang200669

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我以前試過(guò)，用260/280是2.0、1.8、1.7的RNA分別反轉(zhuǎn)錄做熒光，內(nèi)參的CT值不一樣，2.0的CT值是20，1.7的是28，我的是植物RNA。

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4樓2012-03-28 16:15:12

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果子么么茶

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

看不到不代表沒(méi)有洗滌后產(chǎn)物可能沉淀不是很好倒上清細(xì)致點(diǎn) 不要把產(chǎn)物倒掉了

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5樓2012-03-28 19:16:50

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2樓: Originally posted by wtyyyyy1988 at 2012-03-28 12:58:06:
紫外分光測(cè)的都不是很準(zhǔn)的，關(guān)鍵看你跑的RNA電泳怎么樣，電泳上跑的好的話就沒(méi)什么大問(wèn)題，不要去在意紫外測(cè)的，如果有DNA污染就用Dnase 1c處理下。
沒(méi)有沉淀是正常的，不要發(fā)虛，吸取的時(shí)候小心點(diǎn)就OK啦，但是最 ...

謝謝。我用的是微量核酸測(cè)定儀測(cè)量的260/280，測(cè)完心就涼了，就沒(méi)有跑電泳。

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6樓2012-03-28 20:24:32

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5樓: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-03-28 19:16:50:
看不到不代表沒(méi)有洗滌后產(chǎn)物可能沉淀不是很好倒上清細(xì)致點(diǎn) 不要把產(chǎn)物倒掉了

看不到的話，能倒嘛？會(huì)不會(huì)用槍吸出來(lái)好點(diǎn)？

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7樓2012-03-28 20:25:31

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7樓: Originally posted by 狼在身邊 at 2012-03-28 20:25:31:
看不到的話，能倒嘛？會(huì)不會(huì)用槍吸出來(lái)好點(diǎn)？

看情況看不到還怎么說(shuō) 是不是
看得到的時(shí)候注意點(diǎn) 好不容易提取最后還給倒掉很傷感額。
沒(méi)試過(guò) 應(yīng)該會(huì)好點(diǎn) 貼壁吸

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9樓2012-03-28 20:51:35

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9樓: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-03-28 20:51:35:
看情況看不到還怎么說(shuō) 是不是
看得到的時(shí)候注意點(diǎn) 好不容易提取最后還給倒掉很傷感額。
沒(méi)試過(guò) 應(yīng)該會(huì)好點(diǎn) 貼壁吸

我試試吧，謝謝支持

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10樓2012-03-28 21:05:50

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