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藍(lán)色大大鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
誰(shuí)幫我算一下連接體系�。�？能教我一下嗎？？
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超然渡陳
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西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, Good！我們做的時(shí)候一般載體和片段濃度都很高，很少不加水的。 2012-04-11 22:11:37
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西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, Good！我們做的時(shí)候一般載體和片段濃度都很高，很少不加水的。 2012-04-11 22:11:37
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連接體系是根據(jù)載體大小，目的片段大小，以及載體和目的片段的濃度確定的。有一個(gè)公式，[(ng of vector×Kb size of insert) ÷ Kb size of vector ]×(insert : vector) = ng of insert。 需要注意的有幾點(diǎn)，第一點(diǎn)是一般來(lái)說(shuō)載體與片段比例在3/1--10/1之間， 載體和片段長(zhǎng)度相差不大就用5/1,相差大就用8/1。但是并沒有一個(gè)嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)可以界定具體什么叫差別大什么叫差別不大，所以一次可以做兩個(gè)體系，分別用兩個(gè)不同的比例。 第二點(diǎn)要注意的是，片段和載體用量不要太少，否則連接效率會(huì)非常低一般是確定載體的量來(lái)算需要插入目的片段的量，載體的量在250 ng以上比較好，一兩百也能用，但是太低就不行了。 第三點(diǎn)是連接體系最好不要加水，體系不夠的話說(shuō)的是可以用水補(bǔ)平，但是加水相當(dāng)于人為稀釋了，這樣必然會(huì)降低連接效率。不夠的體系可以稍微調(diào)整載體和目的片段的量。這樣二者比例就不一定是嚴(yán)格的8/1,或者6/1這種嚴(yán)格的整數(shù)，但是沒關(guān)系。 第四點(diǎn)是連接產(chǎn)物很寶貴的時(shí)候，轉(zhuǎn)化時(shí)可以轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的一半，留一半備用。萬(wàn)一這次感受態(tài)做的不好不至于全軍覆沒還得從頭來(lái)過。有備用連接產(chǎn)物就省事多了。只轉(zhuǎn)化一半會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性克隆減少，但是那么多克隆咱不是也只需要一個(gè)陽(yáng)性的就行了嗎。 |
6樓2012-04-09 09:44:13
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3樓2012-04-08 19:10:52
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4樓2012-04-08 20:24:50
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5樓2012-04-09 09:32:01
zy_696969
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西瓜: 編輯內(nèi)容 2012-04-11 22:12
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西瓜: 金幣+4, 鼓勵(lì)應(yīng)助！目的基因和載體算出個(gè)比例就好啦，不必引入單位來(lái)計(jì)算滴 2012-04-11 22:14:25
西瓜: 編輯內(nèi)容 2012-04-11 22:12
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西瓜: 金幣+4, 鼓勵(lì)應(yīng)助！目的基因和載體算出個(gè)比例就好啦，不必引入單位來(lái)計(jì)算滴 2012-04-11 22:14:25
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我們一般是這么做的： 1 先把目的基因和載體以同樣的量上樣跑膠（比如說(shuō)都是3微升上樣） 2 估算目的基因和載體的亮度比"X" 3 公式計(jì)算 回收的PCR產(chǎn)物片段（即目的基因）：回收的載體片段=10:1 目的基因：0.3×10^(-3)(pmol)×660×1331bp=263.538ng 載體：0.03×10^(-3)(pmol)×660×2692bp=53.3016ng 目的基因：載體=(263.538/53.3016)/(目的基因和載體的亮度比"X" )  4 確定連接體系 我們用的是T4連接體系 10微升，其中確定的是： ①10× T4 Buffer 1微升 ②T4 DNA Ligase 0.4微升 ③目的基因和④載體按比例加入這個(gè)體系，如果不滿10微升加⑤ddH2O加滿即可。 [ Last edited by 西瓜 on 2012-4-11 at 22:12 ] |
7樓2012-04-09 15:08:38
8樓2012-04-10 00:36:55
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10樓2012-04-11 20:12:10
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