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[求助]
誰幫我算一下連接體系啊？？能教我一下嗎？？
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2樓2012-04-08 19:03:01
3樓2012-04-08 19:10:52
果子么么茶
木蟲 (著名寫手)
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4樓2012-04-08 20:24:50
gongeleven
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5樓2012-04-09 09:32:01
超然渡陳
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【答案】應(yīng)助回帖
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藍色大大: 金幣+10, ★★★★★最佳答案 2012-04-09 10:54:02
西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, Good！我們做的時候一般載體和片段濃度都很高，很少不加水的。 2012-04-11 22:11:37
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西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, Good！我們做的時候一般載體和片段濃度都很高，很少不加水的。 2012-04-11 22:11:37
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連接體系是根據(jù)載體大小，目的片段大小，以及載體和目的片段的濃度確定的。有一個公式，[(ng of vector×Kb size of insert) ÷ Kb size of vector ]×(insert : vector) = ng of insert。 需要注意的有幾點，第一點是一般來說載體與片段比例在3/1--10/1之間， 載體和片段長度相差不大就用5/1,相差大就用8/1。但是并沒有一個嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)可以界定具體什么叫差別大什么叫差別不大，所以一次可以做兩個體系，分別用兩個不同的比例。 第二點要注意的是，片段和載體用量不要太少，否則連接效率會非常低一般是確定載體的量來算需要插入目的片段的量，載體的量在250 ng以上比較好，一兩百也能用，但是太低就不行了。 第三點是連接體系最好不要加水，體系不夠的話說的是可以用水補平，但是加水相當(dāng)于人為稀釋了，這樣必然會降低連接效率。不夠的體系可以稍微調(diào)整載體和目的片段的量。這樣二者比例就不一定是嚴(yán)格的8/1,或者6/1這種嚴(yán)格的整數(shù)，但是沒關(guān)系。 第四點是連接產(chǎn)物很寶貴的時候，轉(zhuǎn)化時可以轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的一半，留一半備用。萬一這次感受態(tài)做的不好不至于全軍覆沒還得從頭來過。有備用連接產(chǎn)物就省事多了。只轉(zhuǎn)化一半會導(dǎo)致陽性克隆減少，但是那么多克隆咱不是也只需要一個陽性的就行了嗎。 |
6樓2012-04-09 09:44:13
zy_696969
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西瓜: 編輯內(nèi)容 2012-04-11 22:12
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西瓜: 金幣+4, 鼓勵應(yīng)助！目的基因和載體算出個比例就好啦，不必引入單位來計算滴 2012-04-11 22:14:25
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西瓜: 金幣+4, 鼓勵應(yīng)助！目的基因和載體算出個比例就好啦，不必引入單位來計算滴 2012-04-11 22:14:25
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我們一般是這么做的： 1 先把目的基因和載體以同樣的量上樣跑膠（比如說都是3微升上樣） 2 估算目的基因和載體的亮度比"X" 3 公式計算 回收的PCR產(chǎn)物片段（即目的基因）：回收的載體片段=10:1 目的基因：0.3×10^(-3)(pmol)×660×1331bp=263.538ng 載體：0.03×10^(-3)(pmol)×660×2692bp=53.3016ng 目的基因：載體=(263.538/53.3016)/(目的基因和載體的亮度比"X" )  4 確定連接體系 我們用的是T4連接體系 10微升，其中確定的是： ①10× T4 Buffer 1微升 ②T4 DNA Ligase 0.4微升 ③目的基因和④載體按比例加入這個體系，如果不滿10微升加⑤ddH2O加滿即可。 [ Last edited by 西瓜 on 2012-4-11 at 22:12 ] |
7樓2012-04-09 15:08:38
8樓2012-04-10 00:36:55
xiangyunch
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9樓2012-04-11 01:40:53
紫菱Kitty
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10樓2012-04-11 20:12:10
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